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高铁血红蛋白（MetHb）测试盒
一、实验仪器：试管、微量移液器、旋涡混匀器、可见分光光度计（540、602和630nm）
二、适用范围：本试剂盒可测各种动物全血等样本中高铁血红蛋白含量；
三、测定意义：
体内一氧化氮弥散入血后，很快与氧合血红蛋白结合形成高铁血红蛋白（methemoglobin, MetHb），NO与MetHb变化相关，故全血MetHb检测近年来受到临床的广泛重视。同时血液中高铁血红蛋白含量的测定对接触芳香族氨基、硝基化合物所引起的中毒性疾病的诊断与治疗，有重要的意义。
四、试剂组成及配制：
A.试剂一：血红蛋白测定浓缩液，1ml X 2支,2—8℃保存。
血红蛋白测定应用液的配制：临用前将浓缩液用双蒸水1:99稀释，即100倍稀释，现用现配。配好的试剂2—8℃避光保存，可存放一个月以上。
B.试剂二: 高铁血红蛋白测定浓缩液，30ml X 1瓶，2—8℃。
高铁血红蛋白测定应用液的配制： 浓缩液:双蒸水=1:9稀释，即10倍稀释，可存放6个月以上。
C.试剂三：制作还原血红蛋白曲线用
① 白色粉剂 X 1支，2—8 ℃避光保存。
② 稀释液，1ml X 1支，2—8 ℃保存。
试剂三应用液配制：临用前每支粉剂加入1ml稀释液，现用现配，注意避光。
D.试剂四：制作高铁血红蛋白曲线用
① 砖红色粉剂 X 1支，2—8℃避光保存。
② 稀释液，1ml X 1支，2—8℃保存。
试剂四应用液配制：临用前每支粉剂加入1ml稀释液，现用现配，注意避光
五、操作过程：
1、制备抗凝全血：取全血立即加入到肝素抗凝管内，加盖封口，轻轻颠倒混匀。
2、血红蛋白含量的测定：取 0.01ml 全血与 2.5ml 的 100 倍稀释的试剂一应用液（血红蛋白测定应用液），混匀，静置5分钟后，1cm光径，双蒸水调零，540nm处测定各管吸光度值。
3、高铁血红蛋白测定： 取0.05ml全血，加入2.5ml的试剂二稀释应用液（即高铁血红蛋白测定应用液），混匀，静置5分钟后，1cm光径，双蒸水调零，测定630nm处及602nm处吸光度值。如果没有双波长的分光光度计则可以先测定各管630nm处吸光度值，然后再测各管602 nm处吸光度值。但一定要注意各管的编号不要弄错。
六、计算公式：
①、血红蛋白含量的计算：血红蛋白克数/升=540nm处吸光度值×367.7
②、高铁血红蛋白百分比计算： MetHb% = (A630nm—r x A602nm)÷(A602nm x(R— r)) ×100%
③、高铁血红蛋白含量的计算：高铁血红蛋白克数 /升 = MetHb%×血红蛋白克数/升
【注1】 A630即在630nm波长时样本的吸光度值；A602即在602nm波长时样本的吸光度值
【注2】 R与r均为常数，R=1.81；r=0.14。（本研究所测定常数）
即计算公式可以简化为：
①、高铁血红蛋白百分比： MetHb% = (A630nm—0.14×A602nm) ÷(A602nm ×1.67) ×100%
②、高铁血红蛋白含量的计算：高铁血红蛋白克数/升 = MetHb%×血红蛋白克数 /升
七、注意事项：
①、取血后应在1小时内完成实验，否则影响测定结果，因为红细胞中的还原酶可使高铁血红蛋白逐渐还原，使结果降低。但可放-20℃以下冷冻保存，如果血样较多，可将全血分成几小管，每次测试可取其一小管，每次测试可取其一小管，余下各管仍保存-20℃以下以备重复测试，其结果不受影响。
②、本实验可用双波长分光光度计测定，可同时测定602nm处及630nm处吸光度值，进行计算。也可用单波长分光光度计测定，可以先测定各管630nm处吸光度值，然后再测各管602nm处吸光度值。但一定要注意各管的编号不要弄错。
③如果实验室分光光度计没有双波长扫描功能，可以不做标准曲线，直接用本实验室数据。R与r均为常数，R=1.81;r=0.14
④所用器皿要干净。
八、测定原理：
高铁血红蛋白在630nm波长处有一特征吸收峰，而高铁血红蛋白（MetHb）和还原血红蛋白（Hb）在602nm波长处光密度值相等，利用此关系可以通过相应的公式算出高铁血红蛋白含量。
高铁血红蛋白（MetHb）测试盒
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