用于 MS 分析的尿蛋白的制备和 HILIC SPE 净化

该方案描述了使用 MagReSyn® HILIC 进行自下而上蛋白质组学的尿液样品的高效样品制备和净化。

材料：所有试剂和化学品应为分析级或更高级别，最好是 MS 级。

Reagent or Equipment                                                                   Description and catalogue number

MagReSyn® HILIC                                                                          MR-HLC002

Ammonium acetate (NH4Ac)                                                         Fluka A1542-500g

Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)                                            Fluka 40867-50g

Dithiothreitol (DTT)                                                                       VWR 0281-25G

Iodoacetamide (IAA)                                                                     MERCK I1149-25G

Protein LoBind tubes                                                                    Eppendorf 0030108450

Magnetic bead handling station for automated protoco            KingFisher Duo or Flex

Magnetic separator for manual protocol                                    DynaMag™-2 Magnet Catalog number: 12321D

MS grade water                                                                           Pierce™ 51140

Peptide quantification method                                                   Pierce™ Colorimetric (23275) or Fluorometric (23290) Peptide Assay

Adjustable Pipettes

Sodium dodecyl sµlphate (SDS)                                                 MERCK L4509-1Kg

Urea                                                                                            MERCK U5378-1Kg

注意：上面建议的化学品已经过测试，可用于本协议，但也可以使用同等等级的化学品

试剂制备：

DTT Stock: 1M DTT in LCMS grade H2O (prepare fresh)

• IAA Stock: 1M IAA in LCMS grade H2O (prepare fresh, light sensitive)

• Urea sample buffer: 8M urea, 2% SDS (prepare fresh)

• Equilibration Buffer: 15% ACN, 100 mM NH4Ac pH 4.5 (diluted from 1M NH4Ac stock)

• Binding Buffer: 30% ACN, 100 mM NH4Ac pH 4.5

• Wash Buffer: 95% Acetonitrile in LCMS grade H2O

• Trypsin Digestion Buffer: 50mM NH4HCO3 LCMS grade H

注：缓冲液可在 4°C 下保存长达 2 周。

方法：

注意：

该方法是使用 Kingfisher™ 磁性处理站开发和基准测试的。如果您无法使用磁性处理站，您可以遵循下面详述的协议（手动格式）。 • 建议新鲜制备所有缓冲液。 • 应使用标准采集程序采集尿液样本。建议收集第一天早上干净的尿液样本进行临床分析。样品应保存在冰上，直到通过离心处理去除碎片（800 x g，10 分钟）。如果不立即使用，等分试样必须储存在 -80 °C。

尿液制备

1. 在冰上解冻尿液样本

2. 将 100 µl 尿液转移至新的 2ml LoBind® Eppendorf 管中。

3. 添加 300 µl 尿素样品缓冲液并涡旋混合 10 -15 秒。

4. 使用终浓度为 10 mM DTT 在室温下还原 30 分钟。

5. 使用最终浓度为 30 mM IAA 的烷基化蛋白质，在室温下避光 30 分钟。

6. 通过添加另外 10 mM DTT 来淬灭 IAA

微粒平衡：

7. 通过涡旋混合或翻转重新悬浮 MagReSyn® HILIC，以确保均匀悬浮液。注意：当制备多个样品时，请通过定期混合来确保保持均匀的悬浮液，例如在转移所需体积之前倒置或上下移液微粒混合物。

8. 将 10 µl MagReSyn® HILIC (200 µg) 微粒转移至 2 ml Protein Lo-Bind 管中。

9. 将管子放在磁力分离器上，等待 5-10 秒，让微粒澄清。

10. 用移液管吸出运输溶液并丢弃。

11. 将微粒重悬于 200 µl 平衡缓冲液（参见上文）中，同时搅拌（例如轻轻涡旋混合）15-30 秒，以洗涤微粒。

12. 将管子放在磁力分离器上，让微粒澄清。

13. 用移液管吸出平衡溶液并丢弃。

14. 重复步骤 12 – 14。注意：只有在准备好添加样品后，才从微粒中取出第二个平衡溶液（参见下面的步骤 15）。这将确保微粒不会风干，并且在添加样品时可以轻松地重新悬浮。

样品结合和清洗：

15. 将（来自步骤 6）还原和烷基化的样品与 (416 µl) 结合缓冲液（30% ACN，100 mM NH4Ac pH 4.5）以 1:1 (v/v) 比例混合。

16. 转移尿素样品缓冲液 - 将缓冲液混合物与步骤 14 中的平衡微粒结合。注意：如果自动化工作流程，请参阅仪器的体积参数，以确保净化的兼容性。

17. 在室温下孵育 30 分钟并持续混合（例如缓慢涡旋）以确保样品和微粒充分相互作用。

18. 将管子放在磁力分离器上，让微粒澄清。用移液器抽吸除去并丢弃未结合的部分。

19. 用 200 µl 洗涤缓冲液洗涤微粒，并轻轻搅拌混合 60 秒。可选：可以将微粒混合物转移到新的 2ml Protein Lo-Bind 管中，以确保留在管侧壁上的污染物在后续消化步骤中不会重新引入样品中。

20. 将管放在磁力分离器上，并允许 5 -10 秒清除微粒。除去上清液并丢弃。 21. 重复步骤 19 和 20 中描述的清洗步骤。

珠上蛋白质消化：

22. 通过添加 200 µl 50 mM 碳酸氢铵 pH 8.0（含有 1 µg 测序级胰蛋白酶（酶：蛋白质比例 1:30））进行珠上消化，并在 47 °C 下孵育 2 小时。确保充分混合以使颗粒在消化过程中保持在溶液中。可选：还可以将 0.25 µg 测序级 LysC 添加到消化缓冲液中以改善消化。

23. 将管子放在磁力分离器上，等待 5-10 秒，让微粒澄清。

24. 取出肽溶液并放入 0.5 ml Eppendorf LoBind 管中。可选：为了提高肽回收率，可以将微粒与 50 至 100 µl 1% TFA 一起孵育 5 分钟，同时混合，然后将上清液与步骤 29 中的消化溶液合并。

25. 对样品进行真空或冷冻干燥并重悬于 20-40 µl LCMS 溶剂中，例如2% ACN 和 0.2% 甲酸

26. 进行比色肽测定以确定肽回收率并调整 LC-MSMS 分析的负载。可选：可以使用比色测定来评估 HILIC 方法去除 SDS 的效率，该比色测定可以测量肽存在下的 SDS 一致性，例如 Arand、Friedberg 和 Oesch，1992 年中描述的方法。

27. 通过 LC-MSMS 分析消化物。注：如果使用不带陷阱洗脱选项的纳米 LCMS 设置，建议使用标准 C18 脱盐工作流程进一步对消化液脱盐