光的吸收
除了在部分或透明的物质上发生折射、散射、干涉和衍射现象外，还可以产生一种颜色印象，如彩虹、蔚蓝的天空、闪闪发光的肥皂泡、华丽的孔雀羽毛或薄薄的油膜和层，颜色主要通过光的吸收或反射出现在我们的环境中。

物质的“色彩”是通过选择性吸收来自电磁辐射光谱的可见部分的光而产生的。这个范围介于紫外线和红外光之间。在分子水平上，这意味着分子进入电子激发态：通过吸收光量子（光子），电子从占据的最高分子轨道上移走（HOMO = h最远 o被占用 m耳目 o比妥;能源 E1）进入最di的未占用分子轨道（LUMO= l奥韦斯特 u已占用 m耳目 o比妥;能源 E2）已提出。
 

E光子= h ⋅ υ = (h ⋅ c) / λ = ΔE = E 2 - E 1

E光子：光子的能量
h：普朗克常数
υ：辐射频率
c：光速
λ：辐射波长
ΔE：两个能级之间的能量差

被吸收的光子的能量正好对应于两个能级的能量差，即分子只能以离散的能量状态存在，能量被“量子化”，只能以规定的部分被吸收或释放。


紫外/可见光谱
可以测量光的吸收 - 例如在染料溶液中 - 可以测量。定量紫外/可见光谱的基础是朗伯-比尔定律：
 

E = lg（I0 / I） = ε ⋅c ⋅ d

E：吸光度
ε：摩尔消光系数
c：浓度
d：层厚
我0：样品前的光强度
I：样品后的光强度

通过变换方程，得到化合物的浓度c。

c = E / （ε ⋅ d）

兰伯特-比尔定律适用于单色辐射。通过绘制波长上的吸光度，可以获得不同波长的化合物的紫外/可见光谱。

朗伯-比尔定律对于高浓度溶液以及浓度依赖性反应的发生（例如 染料的聚集 代表。

当穿过溶液时，光束变弱，部分光已被溶液中的分子吸收，即忽略散射和反射：  
 

A + T = 1 = (I0 – I)/ I0 + I/ I0

A = 吸收 = 光的吸收部分 = (I 0 – I) / I 0
T = 透射 = 光的透射部分 = I / I 0

因此适用以下内容：

E = -lg (T)

Lambert-Beer 定律中的比例常数是与波长相关的材料常数，并且描述了允许激发的所谓跃迁概率。适用光谱选择规则，即区分允许和禁止的跃迁。最重要的选择规则是保持多重性（见下文）。允许的跃迁具有更高的跃迁概率，因此具有更高的消光系数。对于有机染料，长波吸收最大值处的消光系数值 > 10 5 L mol -1 cm -1；这些是共轭 π 系统中允许的跃迁。

吸收是一个非常快速的过程（10 -15到 10 -14秒），不会发生自旋反转。分子通过吸收光子吸收的能量在激发态的有限寿命后以不同形式再次释放。如果排除光化学反应，则除了以热能形式发射之外，还可能发生荧光或磷光等发光现象。这些基本的光物理过程，其中分子的化学特性保留在最后，可以用 Jablonski 图或 Jablonski 项图的形式图形表示。



其中紧挨着电子能级 S 0 – S 2和 T 1还显示了相关的振动子级别。辐射过程（波浪线）和非辐射过程（线）之间的表示有所区别。

单线态S只有成对电子，总自旋为S = 0；三重态 T 有两个不成对的电子，总自旋为 S = 1；这给出了多重性 M = 2 S + 1（存在磁场时的能级数）。 M = 1 for singlet states and M = 3 for triplet states. 因此，多重性守恒的选择规则仅允许单线态或三线态系统内的转换（“自旋禁止”）。


荧光
荧光（10 -9至 10 -7s) 表示通过从第一激发单重态 S 1的振动能级跃迁到 电子基态 S 0的振动能级 （即在等多重态之间）使受激分子失活时可观察到的光发射（“Kasha 规则”）。因此，观察到的荧光与激发波长无关。
 
GG Stokes 在发光矿物萤石 (CaF 2) 如此命名，可以根据经验与有机分子的某些结构特征相关：非芳烃不显示任何荧光；即使它们有 11 个共轭双键，如番茄红素，也不会，而芳香族化合物几乎能够发出荧光。

因此，在许多（如果不是全部）情况下，刚性和平面分子结构（通常是“芳烃”的情况）可能被视为良好荧光能力的先决条件。
此外，已经表明，将某些基团引入芳烃会削弱荧光。其中包括硝基，这意味着例如硝基苯不会发出荧光。

 
组合 (ISC)
然而，溴或碘原子也会降低荧光。然后人们谈到了内部重原子效应。这些取代基通过更大的自旋轨道耦合促进了实际上自旋禁止的转变为三线态系统。单重态系统和三重态系统的等能振动能级之间的这种相互转变被称为“系统间交叉” ( ISC) 。具有不成对电子的顺磁性物质，例如分子氧 O 2，也充当介导这种转变的催化剂。 三重态 T 1的振动基态失活中的磷光A

 

 在电子基态S 0的振动能级发生的光发射 称为磷光。与只有在激发时才能观察到的荧光不同，磷光也可以在激发结束后发生或持续很长时间（“余辉”）。这又与自旋禁令有关，导致三线态的寿命更长（10 -4到 10 2秒），从而延迟到单线态基态的失活。

 
斯托克斯位移
由于荧光或磷光总是来自电子激发态 S 1或 T的振动基态 v 01发生时，与激发带相比，发射带总是移动到更高的波长，即红移。与荧光相比，磷光移动到更长的波长。

 
内部转换 (IC)此外，可以发生称为
“内部转换”(IC) 的失活，例如，通过从第一电子激发态 S 1的振动基态 到电子基态 S 0的等能电子振动能级的转变 .然后从这种较高的激发振动水平（10 -12s) 放出热量。这种类型的无辐射失活总是比发光过程更快。这个过程似乎对流动性很强的分子特别有效。因此，在脂肪族化合物的情况下，人们发现几乎是内部转变到电子基态并且没有荧光。在大多数其他分子中，非辐射失活过程也支配着发光过程。

 
荧光染料
只有极少数有机染料的非辐射失活速度足够慢，足以保证激发态到基态的转变，在这种转变中，多余的能量通过光子的发射以荧光的形式释放出来。
荧光染料的特征在于其光谱特性，例如激发和发射光谱、荧光量子产率 (η fl ) 和荧光衰减时间 (τ fl )。染料的荧光与激发波长无关。
选择染料作为荧光标记时需要考虑的事项在相应部分中显示。

 
光谱特性
荧光染料的光谱特性在很大程度上取决于分子结构。为了使分子的吸收在可见波长范围 (400 - 700 nm) 内，基态和激发态之间的能量差必须足够低。有机染料最显着的结构特征是共轭π电子系统，即所谓的“发色团”（希腊色载体）。
在大多数情况下，染料的荧光光谱在一级近似下是最长波长吸收带的镜像，荧光通常移动 25 - 40 nm 到更长的波段。


吸收罗丹明染料
最ATTO-染料，发色团具有刚性分子骨架。许多代表属于罗丹明染料家族。这些染料的共同结构元素是呫吨骨架中心碳原子上的羧基苯基取代基。
羧基（红色）位于 2 位或邻位，显着影响所有罗丹明的物理化学性质。例如
，由于存在游离的邻位羧基，ATTO 565和ATTO 590及其衍生物具有在处理这两种染料时必须考虑的特殊性质。用作荧光标记的有ATTO 565和ATTO 590苯基取代基的 4 位或 5 位上的额外羧基：

  

吸收波长对 pH 值的依赖性
邻位羧基的质子化-去质子化平衡影响罗丹明的光学性质发色团强。染料ATTO 565和ATTO 590



的吸收最大值位置对于染料的质子化和去质子化形式是不同的。例如，相对于质子化形式，通过两个羧基的去质子化（添加三乙胺），乙醇中ATTO 565的吸收最大值移动16 nm 至更短的波（亚光）：



染料-螺内酯平衡在平衡状态下， ATTO 565和ATTO 590
也 可以形成去质子形式的无色螺内酯：在羧酸根阴离子对中心碳进行亲核攻击的过程中形成五元环，染料的发色系统被打断, 因此形成的化合物不再被可见光吸收并发出荧光： 螺内酯的比例或这种平衡的位置在很大程度上取决于溶剂、pH 值、温度和染料结构。在极性非质子溶剂中，平衡几乎位于螺内酯一侧；在无水丙酮中是ATTO 565染料的溶液



因此，ATTO 590几乎是无色的。另一方面，在水或乙醇等极性质子溶剂中，平衡——如上所述——几乎在有色形式的一侧。
 
荧光光谱在大多数情况下，染料的荧光光谱是长波吸收带的镜像，这里以ATTO 514
为例可以很好地看出： 荧光最大值通常偏移 25 - 40 nm与吸收最大值相比更长的波。这种所谓的斯托克斯位移



进一步受到激发态寿命期间染料周围溶剂分子重新定向的影响，因此发射发生在较低能量的“溶剂松弛态”。激发期间电子分布变化越大，能量差就越大，因此斯托克斯位移就越大。这在我们的ATTO LS 染料中得到了实际应用。


荧光量子产率 (η fl )
荧光染料最重要的特性之一是荧光量子产率 (η fl )。量子产率描述了发射光子的比率 (n fl) 到吸收的光子数 (n abs )。

η fl = n fl / n abs

因此，荧光量子产率永远不会超过 100%。如上所述，非辐射失活过程经常与荧光竞争，从而降低量子产率。

高荧光量子产率对于通过荧光研究染料当然是有利和可取的。我们将在别处更详细地探讨荧光量子产率
的实验测定。荧光衰减时间 (τ fl )

 

激发后荧光光子的发射是一个统计过程。因此，单个分子保持在激发态的时间也是一个统计量。然而，如果考虑许多相同分子的集合，则会产生明确定义的衰变统计结果。在通过短激光脉冲激发后，分子数量在简单的情况下呈指数下降。激发分子的数量 (n 1 ) 下降到 1/e 系数（约 37%）之后的时间称为荧光衰减时间 (τ fl )。

n 1 (t) = n 1 (0) exp(- t / τ fl )

荧光衰减时间是染料的重要特性，可用于识别染料。我们的ATTO染料的 τ fl值通常在纳秒范围内。荧光衰减时间 的确定在别处描述。分子相互作用 荧光衰减时间与染料的荧光量子产率一样，不是一个固定的量，而是受染料所处环境（即溶剂和温度）的影响。染料的衰减时间和量子产率不是彼此独立的，而是通过以下关系相互关联的： τ fl







= τ 0 × η fl

τ 0是在没有无辐射失活的情况下发生的所谓自然衰减时间(η fl

= 100%)。 因此，荧光衰减时间的变化可以提供有关染料分子局部环境变化的信息。