为 ELISA 试剂盒制备细胞或组织裂解物

与 RayBio ® ELISA 试剂盒一起使用的细胞或组织裂解液可以使用大多数常规方法来制备，例如在RayBio® 裂解缓冲液中匀浆细胞或组织。您还可以使用自己的裂解缓冲液，例如 RIPA 或其他针对免疫沉淀优化的配方。

请注意以下有关裂解缓冲液成分的指南：

1. 避免使用 >0.1% SDS 或其他强变性洗涤剂。一般来说，非离子型去污剂（如 Triton X-100 或 NP-40）是好的，但两性离子型去污剂（如 CHAPS）或温和的离子型去污剂（如脱氧胆酸钠）也可以。

2. 总洗涤剂用量不超过 2% v/v

3. 避免使用叠氮hua钠

4. 避免使用 >10 mM 还原剂，例如二硫苏糖醇或巯基乙醇

我们强烈建议在均质化之前向裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂混合物。大多数通用生化供应公司（包括 Roche、Sigma-Aldrich、Pierce 和 Calbiochem）都备有多种此类产品。由于对蛋白水解的敏感性和裂解液中存在的蛋白酶类型各不相同，因此我们不推荐特定的产品。相反，您选择使用哪种蛋白酶抑制剂组合应基于对您感兴趣的蛋白质和/或组织或细胞类型的文献检索。可以使用磷酸酶抑制剂，但不是必需的，除非试剂盒中使用的抗体特异性识别蛋白质的磷酸化形式。

裂解和匀浆方法的选择包括玻璃珠“粉碎”、粉碎、冻融、超声处理和用研钵和杵粉碎冷冻组织，甚至这些方法的组合。没有适用于所有样本类型的最佳方法；您应该在简要搜索文献后选择方法，以了解在以前的调查中如何准备与您相似的样本。

均质化后，离心裂解物以去除细胞/组织碎片（5 分钟 @ 10,000 xg 或 10 分钟 @ 5,000 xg）并保存上清液。除非新鲜测试，否则裂解物应尽快冷冻并储存在 -20°C（或 -80°C，如果可能）下。在进行任何免疫测定孵育之前再次离心。接下来，使用不受去垢剂抑制的总蛋白测定（例如二辛可宁酸 (BCA) 测定）确定裂解物的蛋白质浓度，并标准化每个样品的体积，以便为每个测定提供相同量的总蛋白。

注意：不建议使用 Bradford 测定法，因为它可能会因洗涤剂的存在而受到抑制。

由于不同的细胞和组织可能含有不同量的蛋白质，作为起点，我们建议每 1x10 6 个细胞或 10 mg 组织使用 500 µL 裂解缓冲液。您可能需要根据您的结果进行调整。匀浆的目标总蛋白浓度应至少为 1,000 µg/mL，但 2,000 µg/mL 或更高会更好。

无论您拥有哪种样品类型，强烈建议您在制备后对所有样品进行分装，以大程度地减少多次冻融循环造成的蛋白质降解。这也确保了进一步实验的样品的可用性。