分子克隆是分子生物学中用于组装重组DNA分子的一组实验方法。

基于质粒的克隆包括 4 个主要步骤：

• 插入 DNA 制备

• 载体DNA制备

• 插入片段与载体的连接

• 转化为感受态细胞

在下面的示例中，我们将描述如何使用 SgfI 和 MluI 将目标插入片段亚克隆到载体中。

插入 DNA 制备

1. 对含有插入片段的载体进行限制性消化

1. 用相应的限制性内切酶消化含有插入片段的载体 DNA。对于我们的示例，使用的限制性位点是 SgfI 和 MluI 位点。 OriGene 拥有全基因组 cDNA 表达载体。

2. 在琼脂糖凝胶上运行消化的插入 DNA 以检查大小并进行凝胶内纯化。
   OTI-TIP：在琼脂糖凝胶上运行纯化的消化插入片段以确认浓度。浓度将进一步有助于建立连接。

2. 从模板进行 PCR 扩增
   
   如果无法用兼容的限制性位点切割插入片段，则可以使用 PCR 来扩增插入片段，使其具有目标序列侧翼的所需克隆位点。

1. 设计包含目标序列侧翼所需克隆位点的引物。免费的在线软件程序可用于设计引物。如果手动设计，我们建议最小长度约为20bp，GC含量为40-60%，Tm为60-65°C。

2. 通过 PCR 扩增模板中的插入 DNA。使用 PCR 纯化试剂盒纯化产物。

3. 用限制性内切酶消化 PCR 产物。在琼脂糖凝胶上运行消化的 PCR 并纯化正确大小的 PCR 带。
   OTI-TIP：在琼脂糖凝胶上运行纯化的 PCR 插入片段以确认浓度。浓度将进一步有助于建立连接。

载体DNA制备

1. 选择适合您的包含多个克隆位点 (MCS) 的克隆载体。 OriGene 拥有超过120 种哺乳动物表达载体，包括病毒和非病毒形式。
   如果需要更多的载体DNA，可以使用热休克或电穿孔方法转化至大肠杆菌感受态细胞，例如DH5 alpha。

2. 用与插入序列（例如 SgfI 和 MluI 位点）兼容的限制性酶消化 3-5 ug 载体。将限制性消化酶在 37°C 下孵育 1 小时。
   OTI-TIP：可能需要更长的孵育时间以确保载体全消化，但不要超过 3 小时。
   OTI-TIP：为防止载体自连接，请用碱性磷酸酶在 37°C 下将消化载体的 5' 末端去磷酸化 30 分钟。

3. 为了减少未切割的载体质粒背景，我们建议在琼脂糖凝胶上运行消化的载体，然后纯化线性载体。
   OTI-TIP：在琼脂糖凝胶上运行纯化的消化载体以确认浓度。浓度将进一步有助于建立连接。

结扎

1. 为了成功连接，您可以使用载体：插入片段摩尔比为 1:3。
   OTI-TIP： 1:1 和 1:10 之间的载体：插入片段比例也可用于进一步优化连接反应。

2. 要确定自连接产生的任何背景克隆，请设置不含插入 DNA 的对照连接。

3. 在 16 oC 下孵育过夜（或根据连接试剂盒中的方案）。

转型

1. 通过电穿孔或热休克方法将 1-2 uL 连接反应转化至大肠杆菌感受态细胞中。
   OTI-TIP：如果插入片段有毒或不稳定，则可以使用专门允许这些插入片段成功扩增的感受态细胞。

2. 转移至 SOC 培养基中以复活转化的细胞。在 37°C 下搅拌 SOC 介质 1-2 小时。

3. 将混合物接种到装有抗生素平板的 LB 上，并在 37°C 下孵育过夜。
   OTI-TIP：对于某些有毒插入物，可能需要较低的温度和较长的孵育时间。较小的菌落可能是正确的克隆。

4. 筛选带有目标插入序列的质粒的集落。通过消化、PCR 扩增和测序确认