重组蛋白广泛用于生物学和医学研究。由于可用于商业用途的简单方法的发展，重组蛋白的表达变得越来越普遍。最重要的是，它极大地增加了可以进行结构和生化研究的蛋白质数量。由于每种蛋白质都是不同的，因此必须针对每种特定蛋白质开发纯化方法和技术，同时牢记蛋白质的预期应用。
我们讨论了影响的众多参数蛋白质表达系统以及如何修改它们以提高它们在不同系统中的产量。
重组蛋白到底是什么？
重组蛋白被描述为“由重组DNA编码的定制或修饰的蛋白”在合适的表达载体中编码所需基因的质粒在特定的宿主表达系统中表达，以产生一定量的蛋白质用于科学研究、治疗或诊断目的。
重组蛋白的大量应用包括如下:
产生重组蛋白需要将相关基因复制到表达载体中，同时受诱导型启动子的调控。
然而，成功表达重组基因需要几个变量，包括正确的蛋白质折叠、细胞生长性状以及转录和翻译水平的适当表达指标。在细菌表面展示重组蛋白在生物技术中有许多可能的用途；然而，这需要对通常在作为融合伴侣的载体蛋白上发现的靶向基序有更深入的理解。
此外，选择表达系统需要了解开发、维持和其他经济因素的成本。
用于生产重组蛋白的表达系统
基因工程已经使在细菌、酵母、昆虫、哺乳动物甚至动物体内生产有价值的重组蛋白成为可能植物细胞。这种生物技术已经广泛应用于医学，到2025年，其市场价值预计将达到4000亿美元。
因为每种宿主细胞都是不一样的，所以不同的蛋白质表达方法产生具有不同生物活性和稳定性水平的重组蛋白质并不罕见。糖蛋白包含超过50%的人类蛋白质和大约四分之一的工业重组药物蛋白质。为了从这些重组蛋白中提取最多的蛋白质，通常需要真核细胞作为糖基化的宿主。
虽然大多数商业生物仿制药是使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞制造的，但治疗性重组蛋白的表达受到动物宿主细胞易受反馈抑制的限制。此外，昂贵的血清或生长因子的高制造成本和流行的动物感染的生物安全问题促使科学家们寻求非动物来源的真核细胞表达方法。由于其有利的特征，包括低生产成本、高生物安全性和蛋白质后修饰特征，植物细胞是合成药物重组蛋白的优选。
由于目前正在进行临床研究的许多生物制药蛋白质，如治疗性蛋白质、抗原和抗体的有效表达，植物细胞表达系统已经获得了国际关注。然而，细菌表达系统仍然是商业水平上的好系统。
细菌表达系统
说到生产重组蛋白，大肠杆菌是常见的来源之一。虽然大部分重组蛋白是在大肠杆菌的细胞质中产生的，但二硫键结合的重组蛋白经常是在周质中合成的。
氧化栖息地和驻留二硫键形成(Dsb)-系统可以通过将这些蛋白质导向周质来增强适当的二硫键。将周质用于具有二硫键的重组蛋白更好，但是穿过细胞质屏障的靶向问题会显著降低周质产量。
让我们看看涉及的因素和条件蛋白质表达优化在细菌蛋白质系统中。
蛋白质序列和基因对可溶性和表达的影响
导致异源蛋白质不表达的一个普遍因素是在感兴趣的mRNA中存在“奇怪的”密码子。有可能通过密码子增强的基因生产来避免这种密码子异常。基因合成的一个好处是，它让你改变基因的密码子偏好，以便更好地与杂交宿主合作。
用不常见的tRNAs加强的表达批次可以克服大肠杆菌重组基因中固有的密码子异常。
表达产量和溶解度都受到靶结构域起始和末端残基的影响。通过分析蛋白质的结构和功能，我们可以找到构建蛋白质结构域的最佳位置。通过将感兴趣的蛋白质序列与同源蛋白质结构相匹配，有可能确定结构域结构未知的蛋白质的合适结构域边界。如果你没有获得同源蛋白质复合物的途径，你应该使用二级解剖部分的预测。
载体对溶解性和表达的影响
DNA序列的某些部分，如Shine-Dalgarno盒、启动子、调控序列、转录终止子、复制源等，控制所需基因的翻译和转录。此外，选择元件被整合到表达载体中以促进质粒在靶细胞中的选择。包含融合标签是大肠杆菌表达载体的另一个基本部分。
当选择启动子框架时，应该考虑下游应用和蛋白质靶类型。当处理潜在有害的蛋白质时，选择基础输出水平较低的启动子系统是明智的。另一方面，为了尽可能提高蛋白质产量，必须选择更有效的启动子。对于易于聚集的蛋白质，可以考虑的一个选择是使用冷休克启动子，允许在较低的温度下表达。
来自细菌和其他更大的生物的蛋白质通常折叠更长时间并粘在一起。在大肠杆菌中，折叠催化剂和蛋白质伴侣可以用来防止蛋白质粘在一起，同时使折叠更容易。两种蛋白质，一种在靶质粒上编码，另一种在独立的质粒上编码，可以共表达。
融合标签在基因水平上附着在特定的蛋白质上，使它们更易溶解或更容易被发现和纯化。你通常必须尝试几种不同的标签，才能知道哪种融合标签能产生最易溶解的蛋白质。此外，标签的定位至关重要，它可以位于感兴趣的蛋白质的C-末端或N-末端。大多数融合涉及N-末端，这种融合有一个优势:与C-末端的对应蛋白相比，它通常提高了可溶性蛋白的表达。
考虑到融合标签的可用性可能阻碍重组合成蛋白的生物学功能，在融合蛋白纯化后酶促消除标签可能是有用的。为了便于标签的去除，建议整合一个对给定序列*特的蛋白酶的分割部分。
宿主原种对异源蛋白表达的影响
细菌变体宿主的发展可以促进异源蛋白质的合成。一些商业销售的大肠杆菌变异体被改造成产生具有特定特征的蛋白质，例如那些易受蛋白水解、具有不寻常密码子或需要二硫键的蛋白质。
蛋白酶缺陷型变体，如大肠杆菌BL21或该菌株的其他变体，被推荐用于易受蛋白水解破坏的蛋白质。当靶基因和表达宿主的密码子频率不同时，会发生氨基酸误掺入、翻译过早终止和翻译停滞。如果不寻常的tRNAs在表达过程中被提供，这种差异将成为过去。使用具有编码稀有tRNAs的质粒的细菌菌株，可以提高含有*特密码子峰值频率的基因的产量。
通过在包括谷胱甘肽还原酶(gor)和硫氧还蛋白还原酶(trxB)的宿主菌株中表达，可以提高含有二硫键的折叠蛋白的溶解性，并有助于胞质二硫键的产生。大肠杆菌周质氧化性很强，有利于二硫键的产生；在这种环境中靶向产生的蛋白质提供了表达含有二硫化物的蛋白质的替代技术。
通过调节表达增加蛋白质溶解度
使用有效的生产启动子和高浓度的诱导剂可以在折叠前发生蛋白质聚集。如果转录和翻译速率降低，新生成的蛋白质在聚集之前将有更多的时间折叠。为了提高蛋白质的溶解性，可以调整以下几个典型方面的表达。
温度:如果生产温度降低到15-25 ℃,重组产生的蛋白质将更易溶解。降低的蛋白质收集、翻译、转录和细胞分裂速率是由于在较低温度下细胞过程变慢。当表达特定蛋白质的温度降低时，易受蛋白水解影响的蛋白质的分解速度减慢。
引发剂的效力:重组蛋白的溶解性和活性可以通过降低转录速率来增强，这可以通过降低诱导剂的浓度来实现。
选择的媒介:最重组蛋白生产通过分批培养来培养细胞。从一开始就将所有必需的营养物质加入到生长培养基中是至关重要的。
优化蛋白质的纯化
- 固定化金属亲和色谱(IMAC)应该用作纯化过程的第一阶段。
- 当需要进一步纯化时，使用凝胶过滤或尺寸排阻色谱法。必要时，离子交换色谱应该作为“纯化”的最后一步
- 有可能删除亲和标签以实现额外的纯化并减少重组蛋白中存在的非原始序列的数量。
为大肠杆菌开发最佳表达系统
根据科学界目前的信息，建议开发一种适合大肠杆菌的表达系统是安全的。它应由促进有效转录、稳定转录物、使翻译稳定、产生真正的重组蛋白而不被截短或延伸的变体污染、保持溶解性并聚集到总细胞蛋白的约20%的DNA成分组成。
这种类型的表达整合了管家启动子s70所确认的共有启动子，并且它可以通过整合UP元件而经历额外的改善。诱导相邻基因的通读转录受到两个缺乏任何因子的强转录终止子的串联排列的阻碍。
在转录物两端发现的反向重复稳定了转录物本身。这些重复序列可以产生茎环结构，阻碍5’端的核酸内切酶活性和3’端的核酸外切酶破坏，但它们不抑制翻译。最后，弹性Shine-Dalgarno序列、下游8bp的AUG起始密码子和延长的UAAU终止密码子确保了有效的翻译。折叠分子伴侣随着新的多肽链同时表达，帮助它们折叠。
然而，有必要指出这样一个结论，即所有的重组蛋白都没有一种*美生产方法。每种蛋白质都有其挑战。为了实现高度的合成，有必要通过系统地调整各种参数来优化每种情况下的工艺。
结论
出于生物技术、医学和实验目的，科学家采用许多策略来调节蛋白质的表达。与非常容易制造的DNA不同，蛋白质只能由细胞或活组织的复杂混合物制造。通过特定表达系统生产重组蛋白的努力可能会从令人满意且相对快速的操作迅速转变为紧张且耗时的过程。通过上述步骤，研究人员和科学家可以使用重组蛋白表达服务来克服这些障碍。
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