膜联蛋白 V  （或膜联蛋白 A5）是胞内蛋白磷脂结合膜联蛋白家族的成员。在流式细胞术和荧光显微镜中，膜联蛋白 V 常用于检测凋亡细胞，因为它能够以钙依赖性方式特异性结合磷脂酰丝氨酸 (PS)。该方法由 Koopman 等人首先报道。 （1994）[1]。

在健康细胞中，PS 通常保留在质膜的内层。细胞凋亡早期伴随着膜磷脂不对称性的丧失，导致细胞表面PS暴露。这种易位是由 Xkr8 扰乱酶被效应器 caspase-3 裂解后激活所介导的。与碘化丙啶 (PI) 等活体染料结合使用，荧光染料标记的膜联蛋白 V 可以区分健康 (Annexin − PI − )、凋亡 (Annexin + PI − ) 和坏死 (Annexin + PI + ) 细胞[2]，并对细胞凋亡和/或坏死导致的细胞死亡进行定量分析。

AF488 是明亮、光稳定、亲水性磺化罗丹明荧光团。该染料在绿色 (FITC) 通道中发射。其最大吸收量最大发射波长为 495 nm。位于 519 nm。

碘化丙啶是一种膜不可渗透的 DNA 染色剂，可根据膜的完整性区分坏死细胞、凋亡细胞和健康细胞。 DNA 结合后，染料在橙红色通道中发射。其最大吸收量最大发射波长为 535 nm。位于 617 nm。

该细胞凋亡检测试剂盒可进行 50 次测试，包含使用 AF488 偶联的膜联蛋白 V 和碘化丙啶标记凋亡和坏死细胞所需的所有试剂。

套件组件

建议的膜联蛋白 V-AF488 最终浓度为 2 至 5 µg/mL，具体取决于所研究的细胞培养物。实验前需要对Annexin V-AF488的不同稀释度进行测试，以确定最佳浓度。

可选用碘化丙啶染色 。如果不需要检查坏死情况，可以跳过此步骤。

重要的！膜联蛋白 V 只能用作具有完整质膜的细胞凋亡的标志物。如果质膜的完整性受到破坏，Annexin V 就会与细胞内的 PS 结合并产生假阳性结果。

溶液的制备

1. 将膜联蛋白 V-AF488 冻干结合物 (11172)管的内容物溶解在 50 µL 去离子水中。 / 将膜联蛋白 V-AF488 冻干结合物 (21172)管中的内容物溶解在 250 µL 去离子水中。

   重要的！ 溶解的结合物应避光保存在  2-8°C 下。  在溶液中，结合物可稳定一个月。如需长期使用，建议分装并保存在-20°C。避免再次冻结！

2. 将 1 份 5x 结合缓冲液与 4 份去离子水 混合，制备所需体积的 1x 结合 缓冲液。

细胞染色

1. 以合适的方式小心地从生长表面去除贴壁细胞。有了悬浮细胞，就从下一步开始工作。

2. 用冷 PBS (pH7.4) 洗涤细胞一次，并用 1x 结合缓冲液洗涤细胞一次。

3. 将细胞重悬于冷的 1x 结合缓冲液中。

4.  在 1.5 mL 微量离心管中收集 100 μL 细胞悬浮液（1×10 5至 1×10 6细胞/mL）。对于流式细胞术，有必要准备带有适当对照的额外试管（参见下面的对照说明）。

5. 将 2-5 µL 的膜联蛋白 V-AF488 溶液添加到每个管中，并在室温下避光 孵育 

   10-15 分钟。

6. 无需预先清洗，向每个管中添加 400 µL 1x 结合缓冲液。

7. （可选）向每个管中添加 5 µL 碘化丙啶。轻轻混合管中的内容物，并在室温下避光孵育 5 分钟。

   重要的！不要清洗细胞以去除碘化丙啶。在数据收集期间，碘化丙啶必须保留在缓冲区中。

8. 染色的细胞应保存在 

   2-8°C 的

    暗处直至分析。

   重要的！由于碘化丙啶对细胞活力的负面影响，必须在染色开始后 4 小时内通过流式细胞术或荧光显微镜进行定量分析。

流式细胞术

1. 对于细胞凋亡和坏死的细胞荧光分析，需要准备以下对照：未染色的细胞（仪器设置的阴性对照）；仅用膜联蛋白 V-AF488 染色的细胞，仅用碘化丙啶染色的细胞（以调整补偿）。

2. 使用 FITC 发射信号检测器分析膜联蛋白 V-AF488 的结合。

3. 使用藻红蛋白发射信号检测器分析碘化丙啶染色。

荧光显微镜

1. 将一滴染色的细胞悬液转移到载玻片上。用盖玻片盖住细胞。

2. 或者，贴壁细胞可以直接在盖玻片上染色。染色后，将盖玻片翻转到载玻片上，将细胞放置在载玻片和盖玻片之间。

3. （可选）用膜联蛋白 V 染色后，可以用 1x 结合缓冲液洗涤细胞，并在成像前将细胞固定在 2% 多聚甲醛中。在与膜联蛋白 V-AF488 一起孵育之前不要固定细胞，因为细胞膜的任何破坏都可能导致膜联蛋白 V 与细胞膜内表面上的 PS 非特异性结合。

4. 使用荧光显微镜对细胞进行成像，并使用 FITC 和罗丹明滤光片组。

染色结果

• 结合了膜联蛋白 V-AF488 的早期凋亡细胞的质膜呈绿色。

• 由于碘化丙啶渗透到细胞中，坏死细胞被染成红色。

• 由于继发性坏死而膜完整性受损的凋亡细胞被染成红色（碘化丙啶），并在细胞表面（质膜）上出现绿色晕圈（Annexin V-AF488）。

• 活细胞保持未染色。