细胞培养前的准备工作
时间：2019-10-28 阅读：948
1范围
本标准规定了致病性嗜水气单胞菌的检验方法。
本标准适用于患病鱼类等易感动物及水样中致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定，也可用于送检菌株的鉴定。
2 致病性嗜水气单胞菌检验程序
2.1 嗜水气单胞菌的分离
2.1.1准备
2.1.1.1各种培养的制备方法见附录A(标准的附录)。
2.1.1.2各种试剂的制备方法见附录B(标准的附录)
2.1.2 待检样本
待检样本可包括病料、水样及送检菌株，病料既可是无菌采取的易感动物的肾、肝、脾等未污染病料，也可是粪便或病变皮肤等污染病料，如样本为菌株，应先接种于普通肉汤28℃培养24h，再划线接种于普通琼脂平板，使之形成单个菌落，以供鉴定用。
2.3 分离
2.1.3.1未污染病料的分离
2.1.3.1.1接种环(铂金耳)火焰灭菌，冷却。
2.13.1.2 用接种环蘸取病料
2.1.31.3划线接种于普通琼脂平板。
2.1.3.1.4 28℃培养24h。
2.13.2 污染病料的分离
2.1.3.2.1接种环(铂金耳)火焰灭菌，冷却。
2.1.3.2.2用接种环蘸取病料。
2.1.3.2.3接种于RS琼脂平板
2.1.3.2.4 28℃培养24h。
2.1.3.3 水样的分离：
2.1.3.3.1用孔径为0.2pm的硝酸纤维素微孔滤膜过滤水样。
2.1.3.3.2取出滤膜，置含有灭菌碱性蛋白陈水的试管中。
2.1.3.3.3 28℃培养24h。
2.1.3.3.4划线接种于普通琼脂平板。
2.1.3.3.5 28℃培养24h。
2.2嗜水气单胞菌的鉴定
2.2.1菌落形态
嗜水气单胞菌在普通琼脂平板上。电热恒温培养箱28-C培养24h后的菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄色，有特殊芳香气味
2.2.2 氧化酶试验
2.2.2.1用铂金耳挑取普通琼脂平板上单个菌落少许。
2.2.2.2涂布于浸有1%盐酸四甲基对苯胺的滤纸片上。
2.2.2.3 10s内观察细菌涂布处的颜色。
2.2.2.4 若细菌涂布处出现红色，判为阳性。
2.2.2.5嗜水气单胞菌应为阳性。
2.2.3AHM鉴别培养
2.2.3.1用铂金耳挑取普通琼脂平板上氧化酶试验阳性的单个菌落少许。
2.2-3.2 穿刺接种AHM鉴别培养基
2.2.3.3 37C培养24h。
2-2-3.4 嗜水气单胞菌的表现为:顶部仍为紫色，底部为淡黄色;细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力阳性;部分菌株顶部呈黑色。
2.2.4 吲哚试验
2.2.4.1在长有细菌的AHM鉴别培养基顶部，滴加3-4滴Kovacs试剂，
2.2-4.2若沿试管内壁出现红色环者，表明产生叫噪，判为阳性。
2.2.4.3嗜水气单胞菌应为阳性。
2.2.5 革兰氏染色
2.2.5.1在一干净载玻片上滴加一滴蒸馏水。
2.2.5.2用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。
2.2-5,3在载玻片上与蒸馏水混合并均匀涂布。
2.2-5.4 自然干燥，火焰固定。
2.2.5.5加草酸钱结晶紫染液染1min-2min,
2.2-5.6 流水冲洗。
2.2.5.7加革兰氏碘液作用1min-2min,
2.2-5.8流水冲洗。
2.2.5.9加复红酒精染液染50s-60s,
2.2.5.10流水冲洗。
2.2.5.11干燥，镜检。
2.2.5.12 嗜水气单胞菌应为革兰氏阴性短杆菌。
2.2.6 糖发酵试验
2.2.6.1用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。
2.2-6.2分别接种葡萄糖、蔗糖、阿拉伯搪、七叶昔及水杨昔等5种糖发醉试验管。
2.2.6.3 电热恒温培养箱28℃培养24h,
2.2-6.4 凡试验管颜色从紫色变为黄色，表明细菌可发酵该种糖类，判为阳性。
2.2.6.5嗜水气单胞菌可发酵以上5种糖类。
2.3嗜水气单胞菌致病性鉴定
2.11脱脂奶平板试验
2.3.1.1用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许
2.3.1.2 接种划线于1%脱脂奶蔗糖胰蛋白脉平板(见附录A中A6)。
2.3.1.3 28℃培养24h,
2.3.1.4 若菌落周围出现清晰、透明的溶蛋白圈，判为阳性
2.3.2 斑点酶联免疫试验
2-3-2.1用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。
2.3-2-2接种蔗糖胰蛋白陈肉汤，
2.3-2.328℃摇床(30r/min)培养48h。
2.12.4 10000r/min离心10min，取上清。
2.3.2.5用微量加样器取5uL点样于硝酸纤微素膜光面。
2.3.2.6 电热恒温培养箱37℃烘干。
2.3.2.7 N20%脱脂奶中，37℃封闭1h,
2.3.2.8用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗5次，每次2min
2.3.2.9置1：50兔抗嗜水气单胞菌蛋白酶抗血清中，37℃作用1h。
2.3.2.10用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗5次，每次2min。
2.3.2.11置1：10酶标羊抗兔抗血清中，37℃作用1h。
2.3.2.12 用含吐温-20的磷酸盐缓冲液洗5次，每次2min。
2.3.2.13加3,3一二氨基联苯胺一过氧化氢中显色。
2.3-2-14 待斑点明显后，用去离子水终止显色。
2.3-2-15 设无菌肉汤作阴性对照。
2.3.2.16 以出现明显棕色斑点者判为阳性。
3试验结果分析判定
符合以下特性者应判为致病性嗜水气单胞菌:
a)在普通琼脂平板上，28℃培养24h后的菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄色，有特殊芳香气味;
b)在AHM鉴别培养基中，顶部仍为紫色，底部为淡黄色;细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力阳性;部分菌株顶部呈黑色;
c)氧化酶试验阳性，革兰氏染色为阴性短杆菌;
d)叫噪试验阳性，发酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶昔及水杨昔等5种糖类;
e)脱脂奶平板试验阳性或斑点酶联免疫试验阳性。
各种培养基的配制方法
Al普通肉汤
cas 3.0g
蛋白陈 10.0g
氯化钠(NaCI) 5.0g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.0g
蒸馏水 1000mL
混匀，加热溶解，调pH至7.6，分装，112kPa高压灭菌15min,
A2 普通琼脂平板
cas 3.0g
蛋白陈 10.0g
氯化钠(NaCI) 5.0g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 1g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
混匀，加热溶解，调pH至7.6，分装,112kPa高压灭菌15min，冷却至45℃倾注灭菌平板。
A3 RS琼脂平板
L-盐酸鸟氨酸 6.5g
L-盐酸赖氨酸 5.0g
L-盐酸半胧氨酸 0.3g
麦芽糖 3.5g
硫代硫酸钠(NaIS10·5H20) 6.8g
拘摊酸铁胺 0.8g
脱氧胆酸钠 1.0g
氯化钠(NaCI) 5.0g
酵母提取物 3.0g
新生霉素 0.005g
澳察香草酚兰 0.03g
琼脂 13.5g
蒸馏水 1000ML
混合溶解，调PH至7.0,煮沸1min，冷却至45C，倾注灭菌平板。
A4 碱性蛋白膝水
蛋白脉 10.0g
氯化钠(NaCI) 8.5g
蒸馏水 1000ml
混匀，加热溶解，调PH至9.0，分装，112kPa高压灭菌15mine
A5 AHM鉴别培养墓
蛋白膝 5.09
酵母提取物 3.09
胰蛋自陈 10.0g
L-盐酸鸟氨酸 5.09
甘露醇 Log
肌醇 10.0g
硫代硫酸钠(NaIS203·5H20) 0.4g
拘棣酸铁胺 0.5g
澳甲酚紫 0.02g
琼脂 3.0g
蒸馏水 1000mL
混匀，加热溶解，调PH至6.7，分装，112kPa高压灭菌15min,
A6脱脂奶蔗箱胰蛋白膝平板
磷酸二氢钾(KH2P04) 10.0g
(KCI） 1.5g
蔗糖 5.0g
胰蛋白陈 5.0g
脱脂奶粉 10.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
混匀，加热溶解，调PH至7.0，分装，112kPa高压灭菌15min，冷却至45℃，倾注灭菌平板。
A7蔗精胰蛋白膝肉汤
磷酸二氢钾(KH2PO4) 10.08
(KCl) 1.5g
蔗糖 5.0g
胰蛋白陈 5.0g
脱脂奶粉 10.0g
蒸馏水 1000mL
馄匀，加热溶解，调PH至7.0分装，112kPa高压灭菌15min 。
附 录 B (标准的附录)各种试剂配制方法
Bl Kovacs试荆
对二甲基氨基C11H14O2 5.0g
戊醇 75g
浓盐酸 25mL
B2 草酸铁结晶紫染液
甲液
结晶紫 2.0g
溶于95%乙醇20mL
乙液:
草酸铵 0.8g
溶于蒸馏水80mI。
使用前将甲液和乙液混合。
B3 革兰氏碘液
碘(I） 1.0g
碘化钾(KI） 2.0g
蒸馏水 100mL
B4 复红酒精染液
碱性复红 0.4g
95%乙醇 100mL
B5 箱发酵试验管
先配蛋白脉水(蛋白脉5.0g,蒸馏水1000mL，调pH至7.4，分装，每瓶100mL).
每100mL蛋白脉水中分别加人葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶昔及水杨昔1.0g，充分溶解，分装试管，106.44kPa高压灭菌10min,
B 6 含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)
样品：氯化钠(NaCI) 8.0g
(KCl) 0.2g
磷酸氢二钠(Na2HP0,) 1.44g
磷酸二氢钾(KH,PO,) 0.24g
蒸馏水 800mI
调pH至7.4，加水定容至980mL;吐温-80(Tween-80)20mL.
B7 3,3一二氮基联苯胺一过妞化氮
先配二经甲基氨基甲烷一盐酸(Tris-HC1)缓冲液含(氯化钠8.0g，KCl0.2g,Tris3.0g，蒸馏水800mL,调pH至7.4，加水定容至1000ml)。
Tris-HCI缓冲液 50ml
二氨基联苯胺 250mg
临用前取10ml,用蒸馏水10倍稀释至100ml，加30%过氧化氢300ul。