细胞培养三种重要试剂总结大全！！！

                                                         检硕科学器材（上海）有限公司

           培养基

液体培养基贮存于4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 oC 水槽中温热。 

液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，  可以再添加适量glutamine。

粉末培养基配制(以1 升为例)： 

    3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为  7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成  pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生  长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。 

   3.2. 材料： 

   3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)  3.2.2. 粉末培养基  

   3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)  3.2.4. 电磁搅拌器  3.2.5. 无菌血清瓶  

   3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜  3.2.7. pH meter  3.2.8. 真空帮浦  3.2.9. CO2 气体    

  3.3. 步骤：

  3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。 

   3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200ml  milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 

   3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后  溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。 若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，  pH 会升高0.1-0.2。 

  3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养  基种类、日期、瓶号等，贮存于4 oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤)   

  3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 

  4. 配制培养基之生长测试  

  4.1. 材料： 

 4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)  4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)  4.1.3. methanol  4.1.4. glacial acetic acid  

4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 

  4.2. 步骤： 

  4.2.1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35  mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。4.2.2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群  落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 

  4.2.3. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静  置10 min。 

  4.2.4. 去除固定液，水洗二次。 

  4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。4.2.6. 去除染液，水洗二次。 

  4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不  佳，则丢弃之。

抗生素

1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素  

1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。 

1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待  token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 

2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask 时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml +  streptomycin 100 ug/ml)。 

3. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制  mycoplasma 生长。 

4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin  250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。 

5. 抗生素使用种类与浓度： 

工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌  

penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria  

streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria  

chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria  

gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma  amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds  nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds  fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds 

血清

1. 血清必须贮存于–20 ～ -70 oC，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一  瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %，  必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 

2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加  入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。 

3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 oC 或–70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室  温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇  晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20 oC 直接  至37 oC 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 

4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分钟加热已*解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均  匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建  议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and  platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell  type。

5. 勿将血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较  不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。 

 6. 血清之沈淀物  

6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性  及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本  身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上  清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会  阻塞过滤膜。 

6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。 有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清  放在37 oC 中欲培养此“微生物“，但在37 oC 环境下，又会使此沈淀物增多，更  会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此  小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批  号的血清。

7. 血清之生长测试  7.1. 材料： 

7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)  

7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )  7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish)  7.1.4. methanol  7.1.5. glacial acetic acid  

7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)  7.2. 步骤： 

7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80  % confluency。 

7.2.2. 以trypsin-EDTA 处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM 制成细  胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1×102 活  细胞数/ ml。 

7.2.3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同浓度的血 

清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最终浓度为10  % , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培养箱培养5-7 天，期间不需更换培养基，待细胞群落大  到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。 

7.2.5. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室温下静  置10 min。 

7.2.6. 去除固定液，水洗二次。

7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。7.2.8. 去除染液，水洗二次。7.2.9. 以肉眼计数群落数  

7.2.10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )：SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %  7.2.11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)： 

SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %  7.3. 比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。7.4. 订购多量同一批号的优良血清，置于–70 oC 保存之