SDS-PAGE电泳的常见问题解析

                                                     检硕科学器材（上海）有限公司

1.关于凝胶的一些问题

胶的凝结不好，例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下，在分离胶的下部有波浪样的花纹，凝胶不均匀。解决方法：加大TEMED和过硫酸胺的量，使其凝结速度加快。同时洗干净玻璃板，防止有残留的胶干结在玻璃板上。

胶不凝，解决方法：温度较低时加大TEMED和过硫酸胺的量，过硫酸胺必须新鲜配制。如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。

胶易碎，例如浓度较高的胶在染色和脱色过程以及扫描过程中破裂。解决方法：首先在上述过程中一定要动作轻缓，其次在室温较高的情况下可以适当减少TEMED和过硫酸胺的量。

电泳完后胶上有很多长条纹的杂带，解决方法：建议电泳缓冲液不要回收利用。配制胶的溶液一定要纯。

2.凝胶时间不对

通常胶在30分钟到1小时内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，AP剂量不够。如果凝的太快，可能是AP和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

3.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳的影响

前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的，一般对电泳结果不会有太大的影响。

4.样品的处理

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，形成SDS与蛋白相结合的分子。

带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止纹理现象的产生。100uL样品缓冲液中加入10uL20%的碘乙酸胺，并在25℃下保藏30min。

非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

5.条带两边翘起中间凹下的原因（︶）

在较厚的凝胶中，由于凝胶不均匀冷却，中间部分凝固不好。

电泳系统温度偏高。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

6.条带两边向下中间鼓起的原因（︵）

一般原因是两板之间的底部间隙气泡未排除干净，或聚合不*。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

7.条带偏斜

原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。

8.条带两边扩散

原因：加样量过多。

9.电泳的条带过粗

电泳中条带很粗是常见的事，主要是浓缩胶的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确；适当降低电压。

10.目的蛋白质条带模糊

电泳凝胶浓度选择不当。

低于10Kd的小分子蛋白质要用Tricine胶。

靠近前沿的电泳带分辨率不佳。根据分子量与凝胶孔径的关系，选择适当浓度的凝胶。

蛋白质样品水解。注意除去蛋白质样品的内源性的水解酶，不要反复冻融。

电泳时间过长或过短。溴酚蓝达到分离胶的底部即应该关闭电泳电源。

缓冲溶液、SDS都要新鲜配制。

避免加样过多，提高分辨率。小体积样品可给出窄带，加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15uL（即2-10ug蛋白质）。

加热变性后的蛋白质样品要放置到室温即电泳，不要久放，因为蛋白质的二硫键在高温下可能是会断开，但是暴露于空气中温度降低会重新形成二硫键，而且可能在过久放置过程中蛋白质可能会再折叠，更不要扔到冰箱里保存。

11.“鬼带”的出现及处理

“鬼带”就是在跑构象复杂的蛋白质大分子时，在泳道顶端出现一些未知条带或在加样孔底部生成沉淀，这主要是因为还原剂在加热的过程中被氧化失活，使解离的蛋白质分子重新折叠和亚基重新缔合，由于其分子量通常要比目标条带大，所以会生成未知条带或沉淀。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

12.拖尾现象

主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

13.纹理现象

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

14.溴酚蓝不能起到指示作用

我们在实验中有时会出现溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。

主要原因：缓冲液和分离胶的浓度过高。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

15.甘氨酸在电极缓冲液中的作用

SDS-PAGE中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸，电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。

16.电泳电压很高但电流很低

现象：电压50v以上，可电流却在5mA以下。

主要原因：电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：内外槽装反；外槽液过少等。

处理办法：正确装配电泳槽即可。

17.如何提高SDS-PAGE电泳分辨率

使聚丙烯酰胺的充分聚合，可以提高凝胶的分辨率。

建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。

18.电泳时间比正常要长

可能是因为凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

19.配胶缓冲液系统在电泳中的影响

缓冲液在电泳过程中的主要作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应，正极发生的是氧化反应，负极发生的是还原反应，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。缓冲液可以维持溶液两极的pH保持基本不变。在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动并聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

                                                                                                                                      本篇转载至实验之家