肿瘤治疗过程中，对治疗反应的预测可能对治疗选择和优化其递送参数中起到关键作用。来自俄罗斯和加拿大的研究人员M. A. sirotkina等将光学相干血管造影术（OCA）作为成像方法，使用小鼠耳移植肿瘤模型（CT-26）进行了临床前试验，观察正常和病理灌注血管，并监测了血管经靶向光动力疗法（PDT）后的治疗反应。还提出了一种稳定简单的以微血管作为度量的方法，即PDT后t = 24h，肿瘤和肿瘤周围区域的灌注血管密度（PVD），用以判断PDT的成功。同时经组织学验证，进一步证实了OCA微血管度量的出色早期预测能力，以及肿瘤周围微血管在决定长期PDT反应中的关键作用。

  背景

 光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）是光照治疗的一种，它凭借创伤小、毒副作用小、选择性好、可重复性好、可保护容貌及重要器官功能等优点，日渐成为一种颇具前景的肿瘤治疗手段，尤其是小实体肿瘤。光动力疗法的作用机制是光敏剂分子被光活化，在良好的组织血液供应和氧合条件下形成单线态氧及其他活性氧类物质，导致肿瘤细胞坏死和凋亡。其中，光敏剂在癌症区域的吸收、激发光的3D空间分布、以及受照射组织中的氧张力都会影响PDT治疗效率，因此需要对这三个因素进行适当控制以确保治疗效果。但临床条件下，这些参数随时空变化显著，很难控制，从而也很难预测PDT在个体中的疗效。

 鉴于此，研究人员提出了各种治疗计划、剂量测定、监测和反馈策略来优化和改善PTD的效果。已经有研究通过单线态氧发光或光敏剂光漂白检测来测定PDT剂量，单线态氧发光法高灵敏度且可以直接检测，但由于技术复杂及自身局限性导致无法在临床得到广泛应用。而基于光敏剂光漂白的剂量测定法得到的结果，似乎与长期临床结果联系不大。

 已知微血管系统是组织供氧的手段，也是光动力疗法的潜在靶点，因此血管造影成像可能为监测PDT反应提供一种途径。光学相干断层扫描（OCT）具有出色的3D空间分辨率、成像速度快且无创，能以多种无造影方式检测血液微循环。已经开发的各种OCT血管成像方法包括Doppler OCT, speckle variance OCT和phase variance OCT，在微血管探测率、对大块组织运动稳定性、血管阴影伪影、血流检测与微血管网络可视化等方面都有相应的优缺点。本研究采用光学相干血管造影术（optical coherence angiography, OCA）能够对流动血液灌注的活跃微血管进行灵敏3D检测，提供显微结构和功能性微循环图像，这对于监测PDT过程中的灌注情况非常重要。结合临床前和临床研究，证明用OCA对血液灌注反应监测，可在抗肿瘤治疗监测和结果评估中发挥潜在用途。

 已知在治疗期间和/或治疗后不久（约几小时），监测肿瘤血管的损伤情况，可能会帮助预测出肿瘤对PDT的最终反应。在之前的耳肿瘤模型研究中，研究人员得出了一个简单方便的判断PDT有效性的标准，即PDT后24小时，OCA图像上没有灌注血管。但由于数据量较少（n = 11）且标准过于简单，造成有20%的假阳性率，此外也没有研究PDT对肿瘤周围微血管的损害。事实上，如果PDT没有如期破坏掉肿瘤周围组织中起供应作用的脉管系统，肿瘤就没有被治愈，并可能复发，因此有必要在大量样本中，对肿瘤和肿瘤周围血液灌注中的PDT效应进行更全面的研究。

 研究人员在接种了CT-26鼠结肠肿瘤细胞系的临床前小鼠耳模型（n = 31）中，使用OCA对PDT治疗情况进行了监测。有意选择“温和”的PDT照射方案，以获得有反应者和无反应者的一系列结果。根据PDT后几个时间点（0-24h）OCA对肿瘤及肿瘤周围组织的监测，来预测治疗结果，并将预测结果与治疗后7天组织学显示的治疗结果相关联。结果发现从t = 24h的OCA图像得出的微血管指标，能够准确区分出有无应答。

  结果

 基于OCA的PDT结果评估所用的可控肿瘤模型

 对比正常组织和肿瘤组织的OCA图像，血管结构存在显著差异。肿瘤脉管系统中由于活跃的新血管形成和血管发生，比肿瘤周围组织脉管系统更密集，且扭曲度更高（图1a，b）。

图1 用于OCA观察的小鼠耳模型中，灌注的微血管网络结构。（a）3D OCA数据的2D投影，为正常耳朵微循环；（b）在小鼠耳朵中生长的CT-26肿瘤的OCA图像（肿瘤细胞接种后两周）；（c，d）小鼠耳朵的照片。黑色虚线为OCA成像区域，2.5 × 2.5 mm²。
 

 01-肿瘤及肿瘤周围PDT效果的OCA可视化

 图2a为PDT前，肿瘤及肿瘤周围灌注微血管的OCA成像。在PDT后几个时间点（即刻、t = 5h、t = 24h）进行OCA成像，并在t = 24h检测到肿瘤及肿瘤周围组织中发生zuimingxian的血管反应。图2b表明肿瘤部位无灌注血管，且肿瘤周围组织中灌注血管密度（PVD）非常低，二者同时出现可能表明PDT治疗成功，即有应答。此外有些动物肿瘤本身中没有灌注血管，但是肿瘤周围组织中可见的一些有活力的灌注血管（图2c），随后证明是无应答。
 

图2 PDT后t = 24h肿瘤及肿瘤周围，灌注微血管的OCA图像。（a）PDT前。（b）有应答的OCA实例：肿瘤内无可见灌注血管，肿瘤周围组织PVD极低。（c）无应答的OCA实例：肿瘤内无灌注血管，但肿瘤周围组织有许多灌注血管。虚线处为肿瘤边界。

  02-对OCA图像量化以用于PDT结果预测

 对获得的3D微血管灌注图谱进行量化和分析，以获得用以准确预测PDT结果的OCA源标志物。首先检查PDT前的数据，在31个样本中，根据PDT前的肿瘤PVD可产生20个正确预测结果（准确率70%，威尔逊区间=48-75%）。根据肿瘤周围组织PVD可产生18个正确预测结果（准确率58%，威尔逊区间=42-74%）。因此，PDT治疗前的微血管灌注状态似乎不能用于可靠预测PDT反应。当加入PDT后的数据，OCA预测精度提高了（图3c）。统计了PDT后三个时间点（即刻、t = 5h、t = 24h）的正确预测结果（CPO），总结在表1中。

 

图3 治疗后OCA衍生的PVD变化，用于预测PDT是否成功。（a）肿瘤中PVD随时间变化情况。（b）肿瘤周围组织中PVD随时间变化情况。（c）PDT治疗后，三个时间点中，基于PVD值的正确预测结果的百分比。



 

表1 在不同时间点，根据肿瘤及肿瘤周围PVD得到的，正确预测结果（CPO行）、相应的置信区间（CI行）、用于区分有应答和无应答者的PVD值阈值（PVD阈值行）的汇总。

 根据数据可以得出几个判断，首先证实了研究人员之前的观察结果，即只有无应答的肿瘤OCA图像上有灌注血管（PDT后t = 24h）。因此，如果在肿瘤区域内观察到有任何灌注血管，则认为PDT不成功（图3a）。然而反过来，治疗后肿瘤内的灌注血管并不都是缺失的，是否有灌注血管不能预测PDT的结果。本研究中13例无应答中有8例在PDT后t = 24h时肿瘤内没有灌注血管。其次从表1中不断增加的CPO可以看出，PDT后经过的时间越长，预测精度越高。

 检查t = 24h的数据，可注意到在有应答样本的肿瘤周围组织中，PVD比PDT前下降了一个数量级（0.38±0.22 vs 3.14±0.57%）。相比之下，无应答样本的PVD略有减少（2.21±0.86% vs 3.29±0.59%）（图3b）。根据这些趋势可得出治疗结果预测标准的公式，阈值可设置为有应答组中最高PVD值和无应答组中zuidiPVD值之间的平均值，即本研究中阈值= 1%。使用该阈值根据t = 24h肿瘤周围PVD的测量值，正确地预测了所有31例样本的结果（准确性= 100%，威尔逊区间=89–100%）。

 综上所述，可以根据PDT后t = 24h的OCA可视化结果制定一个简单易行的预测方案，即如果肿瘤内的OCA图像中有任何灌注血管，则认为PDT不成功；如果肿瘤内没有发现灌注血管，则应额外评估约2 mm附近的周围组织，如果该区域灌注血管的总密度在OCA图像上不超过1%，则可认为PDT是成功的；偏离这个标准为无应答。图解总结见图4。



 

图4 基于OCA的PDT成功评估方案的图解总结，基于治疗后t = 24h的肿瘤及肿瘤周围微血管反应。
 03-组织学验证

 所有OCA检查过的动物在PDT后7天接受组织学评估验证。研究人员根据之前的研究，将组织学上肿瘤总坏死率> 95%的划分为有应答（图5a），将肿瘤坏死率< 95%划分为无应答（图5d）。对于PDT有应答样本，肿瘤周围区域，包括距肿瘤边缘约2 mm的“正常”耳组织，都显示缺血，并在组织学上可以清楚地看到坏死（图5b，c）。对于无应答样本，PDT后7天，在肿瘤边缘即约2 mm以外的肿瘤周围组织都没有损伤。有应答和无应答中均观察到组织病理学可见的坏死受照射肿瘤组织，但部分可能是由于血管的血栓形成，这表明仅局部肿瘤反应不足以预测治疗结果，肿瘤周围微血管系统也发挥关键作用。事实上，在PDT成功样本中，距病理边缘约2 mm的肿瘤周围组织OCA上无灌注血管（t = 24h），有组织坏死（t = 7天）。

 无处理和仅光照的对照实验样本在整个观察期间，图像上都显示出发育良好的肿瘤血管网络，在研究结束时显示出80-100%的活肿瘤细胞。



 

图5 PDT后t = 7天治疗结果的组织学评估。左侧为有应答。（a）肿瘤中心部分的总肿瘤坏死率（> 95%）。（b）距肿瘤边缘约2 mm的“正常”耳组织（但仍在PDT治疗范围内）*坏死。右侧为无应答。（c）部分肿瘤坏死（~75%）和活肿瘤区。（d）未受损的“正常”耳组织，距离肿瘤边缘约2 mm（但仍在PDT治疗范围内）。


 总结
 本研究提出了一个准确早期（治疗后24小时）预测PDT成功的标准：即在肿瘤边界内的OCA图像中不应有可见的灌注血管，并且在2 mm范围内的肿瘤附近区域，灌注血管密度不应超过OCA图像尺寸的1%。已有类似研究结果能与之匹配，如Kutsuyoshi等人证明了阻断肿瘤及肿瘤周围血液循环，在预防癌症复发的临床策略中具有很大的潜力。在未来的临床应用中，OCA成像可用于监测肿瘤治疗中PDT疗效，以及时对治疗方案进行修正。
 

参考文献：

Sirotkina, M. A. , et al. "Accurate early prediction of tumour response to PDT using optical coherence angiography." Scientific Reports 9.1(2019).