皮肤辐射损伤（CRI）是由暴露于高剂量电离辐射（IR）引起的皮肤损伤。由于最初的临床潜伏期和随后的炎症爆发，导致CRI的诊断和治疗较为困难。因此临床症状出现前早期检测CRI将有助于有效治疗。韩国研究人员JUNGBIN LEE等证明光学相干断层扫描血管造影术（OCTA）可以非侵入性地检测CRI小鼠模型潜伏期内的皮肤变化。通过暴露于各种红外剂量在小鼠后肢诱导CRI，通过OCTA纵向成像损伤的皮肤区域直到临床症状出现。观察发现OCTA检测到皮肤的一些变化，包括皮肤增厚、大血管扩张和血管边缘不规则。组织学研究也证实了OCTA的发现。表明OCTA可用于早期CRI检测。研究成果以“Characterization of early-stage cutaneousradiation injury by using optical coherence tomography angiography”为题发表于Biomedical Optics Express。

  背景

 皮肤辐射损伤（CRI）是暴露于高剂量电离辐射（IR）引起的对皮肤和下层组织的损伤，包括对基底角质细胞和毛囊干细胞等连续分裂细胞的直接损伤，以及随后的炎症。临床中CRI有一个特征，即照射后临床症状延迟发作，其中的无症状期被称为潜伏期。CRI症状在潜伏期后变得明显，根据严重程度出现红斑、水肿、色素变化、干燥和潮湿脱屑、溃疡和坏死等症状。除传统的保守治疗外，目前暂无有效的预防措施或治疗方法。这种连续且不可预测的炎症爆发可导致临床症状诊断和治疗滞后。CRI的早期处理有利于减少损伤区的扩大，提高治疗效果。因此对CRI的非侵入性早期诊断似乎是非常重要的。

 光学成像方法允许对皮肤的局部变化进行非侵入性和敏感的检测，并且已经有各种光学技术测试用于早期CRI检测。3D光学显微如反射共聚焦显微镜（RCM）和双光子显微镜（TPM）显示出的潜力可通过观察潜伏期的细胞变化来进行早期检测。有研究在急性放射性皮炎出现临床症状之前，使用RCM检测到皮肤真皮中的海绵样增生、胞吐和炎性细胞浸润。此外使用RCM和TPM在CRI小鼠模型的临床潜伏期都检测到表皮细胞和皮脂腺的损伤。虽然显微技术的检测灵敏度很高，但视野（FOV）相对较小，实际情况中的筛查范围可能受到限制。受损皮肤中负责氧气、营养物质和其他分子向组织的运输和交换的微循环也会受到CRI影响。高光谱成像（hyperspectral imaging, HIS）和散射光谱法（diffuse optical spectroscopy）可在临床潜伏期检测到脉管系统的灌注和氧合的变化。激光多普勒血流计可测量由CRI引起的血液灌注变化。这些方法测量了与CRI相关的脉管系统的功能变化。而光学成像方法通过血管可视化，能够评估血管的形态变化。光学相干断层扫描血管造影术（OCTA）可以基于光反射实现无创地观察皮肤的微观结构和脉管系统，已经在各种皮肤病学研究中得到广泛应用。有研究利用OCTA发现皮肤厚度和血管密度增加是对紫外线辐射的急性反应。OCTA在患有银屑病、慢性移植物抗宿主病和硬皮病等病理状况的参与者中观察到了毛细血管水平的血管和结构变化。使用OCTA进行过的CRI研究包括检测全身γ射线照射后早期，小鼠耳廓脉管系统的退化和再生。

 本项研究使用OCTA在局部照射小鼠模型的CRI早期阶段观察皮肤的结构和血管变化。在小鼠后肢上以不同剂量照射：0 Gy（对照）、10 Gy、20 Gy和40 Gy，并通过OCTA纵向成像照射的皮肤区域，直到出现临床症状。与明场成像和组织学结果比较，对皮肤的变化进行了定性和定量分析。

 结果
 01-CRI小鼠后肢皮肤的纵向明场成像
 

用明视野成像技术纵向观察CRI无毛小鼠模型的辐照皮肤区域，在照射后每两天拍摄一次纵向明场图像（图1）。可见0Gy（对照）小鼠显示出正常无毛小鼠皮肤的典型特征：皮肤苍白，毛发分布稀疏。而在受照射小鼠从照射后第4天开始出现一些变化。在10Gy组小鼠中，照射后第4天观察到脱毛，然后没有进一步的进展。在20 Gy和40 Gy组小鼠中，照射后第4天观察到脱毛，然后第8天观察到红斑和脱皮。40 Gy组小鼠的临床症状比20Gy组小鼠更严重。研究认为20Gy和40 Gy组小鼠模型的临床潜伏期为照射后6天，因为临床症状出现在第8天。基于明场成像的结果对照射后前8天进行纵向OCTA成像研究。



 

图1 CRI小鼠后肢皮肤的纵向明场成像图。图像下方黑色水平箭头线表示临床诊断及损伤进展。照射后第8天的红框图像表明临床可见的CRI阶段。

  02-高剂量CRI小鼠潜伏期晚期皮肤的典型OCTA图像

 CRI小鼠皮肤的纵向明场图像显示，20 Gy和40 Gy小鼠的潜伏期均为照射后6天，因此对整个潜伏期进行纵向OCTA成像（图2）。正面OCTA图像为MIP图像，OCTA图像分别为50-125 μm（真皮浅层）和100-325 μm（真皮深层）不同深度范围内产生。可见在0 Gy（对照）小鼠中，明场图像和OCT图像都显示正常的皮肤结构：明场图像显示皮肤苍白，毛发稀疏；截面OCT图像显示表层高散射的薄薄真皮，及真皮下弱散射的筋膜或肌肉层。真皮中观察到毛囊和皮脂腺等显微结构。两张正面OCTA图像分别显示了皮肤真皮浅层和深层的毛细血管/小血管以及相对较大的血管，其中大血管边缘平滑。在40 Gy组小鼠中，照射后第6天的皮肤明场图像除显示脱毛外，没有太多可见的变化。然而OCTA检测到皮肤有几处变化。截面OCT图像显示，照射后第6天的皮肤较对照组相比，真皮增厚，反射强度降低。由于皮肤真皮增厚，肌肉和筋膜层出现的深度比对照组更深。正面OCTA图像显示与对照组相比，辐射组真皮浅层的小血管变化不大，但真皮深层的大血管变化显著。大血管扩张，血管边缘不规则。不规则的血管边缘可能为内皮细胞损伤引起的渗漏。此外还有更多的小而扭曲的血管分支。40 Gy小鼠潜伏期晚期的OCTA图像显示，潜伏期内皮肤存在由CRI引起的结构和血管改变。

 

图2 对照（a-d）和40 Gy辐射（e-h）组小鼠皮肤在潜伏期晚期（照射后第6天）的明场图像和OCTA图像。分别为明场图像、截面OCT图像、正面OCTA MIP图像。真皮浅层和深层的OCTA图像分别用红色和黑白描绘。截面OCT图像（b，f）右侧的黑色箭头线标记皮肤表皮和真皮的平均厚度，红色箭头标记真皮底部。40 Gy深层真皮正面OCTA MIP图像（h）中绿色箭头为不规则血管边界。

 03-临床潜伏期皮肤厚度的纵向变化

 在潜伏期间，通过纵向OCTA成像详细分析了CRI小鼠皮肤的变化（图3）。可见在0 Gy（对照）组小鼠皮肤中，OCT图像清楚地显示正常皮肤结构，包括表层高度散射的真皮及下面弱散射的筋膜或肌肉层。由于对当前OCT系统的图像分辨率来说，小鼠皮肤的表皮太薄，因此OCT图像中没有识别最上面的表皮。而在受照射组小鼠皮肤中，10 Gy组小鼠皮肤厚度仍与对照组皮肤厚度大致相同，其余组纵向OCT图像显示皮肤真皮增厚。真皮和肌肉层之间的界限清晰可见。


 

图3 临床潜伏期CRI小鼠皮肤的纵向截面OCT描图像。（a-d）分别为0 Gy（对照）、10 Gy、20 Gy和40 Gy组。红色箭头标记皮肤真皮底部。比例尺横向（x）1mm，轴向（z）400μm。

 

在20 Gy和40 Gy小鼠皮肤中，随着皮肤厚度随时间增加，真皮中的反射强度逐渐降低，而真皮和肌肉层之间的边界也随之变得不那么清晰。但在潜伏期仍然可能找到边界。在观察期间对皮肤增厚进行定量分析（图4）。可见在0Gy（对照）组小鼠中，成像期间皮肤厚度恒定；10Gy组小鼠皮肤厚度与0 Gy小鼠相似，保持不变；然而20 Gy和40 Gy组小鼠中都观察到皮肤厚度逐渐增加，照射后第4天的皮肤厚度明显高于同时期的对照组小鼠皮肤。照射后第6天，20 Gy和40 Gy小鼠的皮肤厚度分别约为0Gy小鼠皮肤厚度的1.49倍和1.62倍。皮肤增厚的原因尚不清楚，可能是由于血管损伤和渗漏。但分析结果表明OCTA可检测潜伏期CRI的进展情况。



 

图4 截面强度OCT图像中的皮肤增厚度定量分析。不同颜色分别代表0Gy（黑色）、10Gy（绿色）、20Gy（蓝色）和40Gy（红色）的皮肤厚度。由0 Gy组的平均厚度标准化，统计显著性：*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001，***p ≤ 0.0001。

04-潜伏期晚期CRI小鼠皮肤的组织学研究
 为证实OCTA检测到的结构变化，对CRI小鼠模型的后肢皮肤进行H&E染色（图5）。可见0 Gy（对照）小鼠皮肤的组织学图像显示正常的皮肤结构：薄的表皮和真皮，真皮中规则分布的毛囊和皮脂腺以及下面的肌肉。10 Gy小鼠皮肤的组织学图像也显示正常皮肤结构，类似于0 Gy（对照）组。20 Gy和40 Gy组小鼠皮肤的组织学图像显示了几种变化：表皮和真皮均增厚；表皮细胞和皮脂腺及毛囊中的细胞簇受损；真皮内有炎性细胞浸润。随着照射剂量增加，这些变化更加严重。这些组织学图像显示了CRI的细胞变化细节，并证实了OCTA观察到的皮肤增厚。



 

图5 潜伏期晚期（照射后第6天）CRI小鼠皮肤的组织学图像。黑色箭头标记出薄表皮和正常皮脂腺。黄色箭头标记增厚的表皮和部分或*受损的毛囊和皮脂腺。带箭头的黑色虚线表示表皮和真皮的深度范围。

05-潜伏期皮肤脉管系统的纵向变化
 

OCTA在潜伏期后期检测到的CRI小鼠皮肤的另一个特征是深层真皮中的大血管变化，因此利用纵向OCTA成像技术对潜伏期大血管的变化进行了详细监测（图6）。正面OCTA MIP图像从距离皮肤表面100-325 μm深度范围手动根据厚度调整生成。0 Gy（对照）组小鼠皮肤的OCTA图像显示了真皮深层的典型脉管系统。大血管直径约100μm，血管直径随着分支而减小。血管在边缘笔直光滑。在10Gy组小鼠皮肤中，OCTA图像显示与0 Gy（对照）小鼠皮肤中相似的血管形态。虽然照射后第5天血管分支略有增加，但大血管的直径和形状保持不变。在20 Gy和40 Gy组小鼠皮肤中，OCTA图像检测到大血管随时间推移发生的变化：血管扩张，血管边缘变得不规则。随时间推移小而扭曲的血管分支越来越多。在20 Gy组小鼠皮肤中，照射后第2天大血管表现正常。随后第3天血管出现扩张和边界不规则并持续发展。在40Gy组小鼠皮肤中，大血管相对较薄，并在照射后第2天局部扩张，第3天出现更多扭曲的血管，然后在潜伏期晚期出现局部扩张和边界不规则性。



 

图6 潜伏期CRI小鼠真皮深层大血管的纵向正面OCTA MIP图像。图中相同颜色箭头代表同一个血管。比例尺1mm。

 

通过分析纵向OCTA图像来量化40 Gy组小鼠皮肤中大血管的直径和边界不规则性变化（图7）。图7a-b和c-d分别为照射后第2天和第6天0 Gy和40 Gy组小鼠皮肤的代表性OCTA图像，放大图像显示用于分析的大血管。在这两天，0 Gy小鼠皮肤图像中的血管看起来都是直的，边界清晰。另一方面40 Gy组小鼠血管在照射后第2天相对比较直，在第6天变大且不规则。图7e和f为潜伏期期间血管直径和边界不规则性的分析结果。40 Gy组小鼠中，照射后第6天皮肤中大血管的平均直径为照射后第2天的1.43 ± 0.05倍。在0 Gy小鼠皮肤中，代表血管边界不规则性的变异系数约为0.14。40 Gy组小鼠皮肤中血管边界变异系数随时间增加，与0 Gy小鼠皮肤相比，照射后第6天明显升高（0.23）。分析结果表明，40 Gy组小鼠皮肤在潜伏期内大血管的直径和边界不规则性均发生显著变化，并且OCTA可以检测到血管的变化。

 

图7 潜伏期不同时间点0 Gy和40 Gy组小鼠大血管的OCTA图像以及血管变化的定量分析。作图分别为照射后第2天和第6天0 Gy组（a，b）和40 Gy组（c，d）小鼠中的大血管OCTA图像。在这两天检测到的相同血管用绿色虚线框标出。（e）辐照后第6天大血管相对于第2天的相对直径。（f）血管边缘不规则。统计显著性：**p ≤ 0.01，***p ≤ 0.001，****p ≤ 0.0001。

结论
 

本研究使用OCTA描述CRI小鼠最初潜伏期皮肤的结构和血管的变化。用不同剂量进行局部照射并进行纵向OCTA成像。观察到在潜伏期，20 Gy和40 Gy高剂量辐射暴露使小鼠模型的皮肤发生了一些变化，如皮肤增厚、大血管扩张和血管边缘不规则。而10Gy低辐射剂量暴露的皮肤中没有观察到这种变化。定量分析发现在20 Gy和40 Gy小鼠皮肤中，从辐照后第4天开始皮肤增厚变得显著，照射后第6天的皮肤分别比对照组小鼠厚约1.49倍和1.62倍。在照射后第2-4天局部观察到大血管的扩张和不规则的血管边界，然后扩散到更多的大血管。组织学研究也证明了皮肤增厚。展现出OCTA在检测结构和血管变化方面的优势，即高成像速度和可深入皮肤真皮的高成像深度。

 虽然本研究存在一定局限性，如目前研究发现的特征可能不适用于人类受试者。但测得的真皮衰减数据可以作为早期CRI检测的一个特征。此外，OCTA的成像速度还可以提高，利用OCTA检测CRI皮肤中功能性的微结构和脉管系统变化，如氧饱和度、氧血红蛋白和脱氧血红蛋白浓度等。结合OCTA成像和光谱成像方法的多模态成像可用于将脉管系统的结构和功能变化相关联，以实现精确和早期检测CRI 。

 总之，作为一种潜在的早期检测方法，OCTA在出现临床症状之前，在暴露于高剂量辐射的小鼠皮肤中检测到皮肤增厚和大血管的变化。对这些变化进行定性和定量分析，并用明场成像和组织学进行了验证。表明OCTA对CRI的早期变化敏感，可作为一种良好的早期检测方法。

 

参考文献：Lee, J. , et al. "Characterization of early-stage cutaneous radiation injury by using angiographic optical coherence tomography." Biomedical Optics Express 11.5(2020).