多路径体内成像对于同时标记不同的分子生物标志物是非常理想的，能够跟踪多个细胞的迁移和体内多种分子的运动。通过利用荧光标记技术，活体显微镜(IVM)可以在活体动物中同时观察多种细胞或分子的活动。然而，即使使用多光子显微镜，IVM的组织穿透也高达400 μ m，难以应用到许多临床前和临床研究。光学相干断层扫描(OCT)是一种新兴的成像方式，允许组织穿透达几毫米，同时在活体中保持高空间分辨率。然而，由于大多数生物、细胞和生物分子缺乏固有的OCT对比度，传统的无标签OCT仅通过检测成像组织的背散射光来显示组织解剖结构。越来越需要开发合适的OCT造影剂，来扩大OCT在细胞和分子成像方面的应用，特别是通过多重造影剂的方式。到目前为止，已经研究了相当多的材料作为外源性OCT造影剂，包括微球、微泡、磁性纳米颗粒和等离子体纳米颗粒。已有研究证明在近红外一区（NIR-I）使用造影剂进行多重成像的潜力，但由于NIR-I光线穿透率低等。在这项工作中，研究者展示了一类新的OCT金纳米造影剂(GNBPs)，具有更窄的等离子体共振峰和更高的光谱灵敏度。通过合成具有不同宽高比和共振峰的GNBP，可以同一动物体内同时显示多个独立淋巴液的流动。在黑色素瘤小鼠中，使用GNBPs能够在体内观测到肿瘤内部和肿瘤边缘的淋巴流动，为研究肿瘤细胞的淋巴结转移提供了重要依据。

GNBP-I和GNBP-II在体外OCT信号对比

使用透射电镜合成了具有相似的表面形态但尺寸和纵横比不同的GNBP-I和GNBP-II造影剂，NIR光谱显示他们的共振峰分别为1225nm和1415nm。使用将带宽内的OCT干涉图划分为两个子带的双波段光谱分析来检测：波段I(1250-1320nm)和波段II(1321-1400nm)。每个子带的干涉图被独立重建，在光谱域产生两幅OCT图像。然后将波段II OCT图像与波段I OCT图像相减，得到光谱对比信号。为了测量光谱对比信号强度作为每种GNBP浓度的函数，使用小鼠全血作为参考，在毛细管中以梯度浓度对GNBP-I和GNBP-II进行成像。在重建的光谱OCT b扫描图像中观察到水和血液中GNBP-I和GNBP-II的两种不同的光谱对比信号，采用色调饱和度值(HSV)方案进行彩色编码。GNBP-I表现出正的光谱对比信号，因为它增强了波段I的散射，但降低了波段II的散射。由于GNBP-II对两个子波段的响应相反，因此显示出负的光谱对比信号，但其在波段II的散射比波段I更强。采用离散偶极近似方法模拟了两种GNBP的散射曲线。随着浓度的增加，两种GNBP的OCT光谱对比信号都更强。分析还表明，GNBP-I的光谱对比信号在5 pM至1 nM范围内随纳米颗粒浓度成比例增加，而GNBP-II的光谱对比信号在5 ~ 100 pM范围内呈线性增加。当纳米颗粒浓度超过500 pM时，可以观察到GNBP-II的光谱对比信号饱和，计算出GNBP-I和GNBP-II的检出限分别为3.6和2.8 pM。

GNBP-I和GNBP-II和体内OCT信号随浓度呈线性相关

在体内实验中，用聚乙二醇(PEG, MW 5 kDa)对GNBP进行偶联，以提高其在生物组织中的稳定性和生物相容性。为了验证GNBP在体内的OCT光谱对比信号，使用两只不同的小鼠耳中皮下注射不同浓度的PEG-GNBP-I和PEG-GNBP-II，并在每次给药后立即在每个注射部位用OCT对组织进行成像。为了避免不同注射剂之间的影响，每次注射的体积很小(0.1 μ L)。此外，为防止局部注射的GNBP在成像过程中扩散到邻近的注射部位,注射距离至少分开1mm。不注射GNBP的小鼠耳组织作为对照，计算GNBP在组织中流动的光谱对比信号，在HSV方案中结合OCT结构、光谱对比和血流信息创建了横截面复合图像。随着注射浓度的增加，两种GNBP在小鼠耳组织中可以观察到更强的OCT光谱对比信号。当GNBP-I浓度为5-50 pM，GNBP-II浓度为5-100 pM时，小鼠耳OCT光谱对比信号呈线性增加。

GNBP-I和GNBP-II能同时显示体内淋巴液的流动

使用PEG-GNBP-1和PEG-GNBP-II同时注射到小鼠耳缘皮下不同位置，在每次注射前后对小鼠耳朵进行OCT扫描并使用双波段信号处理法生成具有门控的OCT图像，以显示小鼠体内血液和淋巴液的光谱对比。注射造影剂前， OCT光谱图像只显示血管网络，该图像中的光谱对比度信号接近于零(颜色编码为青色)由于淋巴液是光学透明的，因此在流控图像中没有信号。在横截面复合图像中，可以看到一条主血管(红色箭头表示)和三条淋巴管(黄色箭头表示)，淋巴管呈现黑色是因为淋巴液产生可忽略的光学反射。在注射GNBP-I后，观察到除了血流门控OCT光谱图像上的血管外，还有一个广泛的管状网络，具有高光谱对比度信号。由于他们能够从间质组织中排出造影剂，表明这些管状网络可能是淋巴管。横断面复合图像显示，所有三条淋巴管均表现出高光谱对比信号(箭头)，证实了注射后流门控OCT光谱图像上出现的光谱阳性网络确实是淋巴管。第一次注射后30分钟，在耳缘另一个远端位置皮下注射第二种造影剂PEG-GNBP-II。第二次注射后，部分淋巴管可见负的光谱对比信号。在横截面复合图像中，可以在其中一个淋巴管(黄色箭头)中观察到负的光谱对比信号。这些连接可能对应于存在于淋巴管室两端的淋巴阀结构，淋巴管室维持淋巴液的单向流动。

GNBP-I和GNBP-II能够在肿瘤内部和肿瘤边缘分别显示淋巴流动

为了成像肿瘤淋巴引流，先在瘤内注射PEG-GNBP-I，然后在肿瘤周围的组织皮下注射PEG-GNBP-II。注射前OCT血管造影中可以看到血管生成的肿瘤和瘤周血管。瘤内注射后，由于GNBP-I在整个肿瘤内扩散，整个肿瘤可见阳性的光谱对比信号。从表面流控OCT光谱图像可以很容易地看到瘤内注射造影剂的淋巴引流路径。不仅肿瘤近侧淋巴管可见阳性光谱对比信号，肿瘤远侧瘤周淋巴管也可见阳性光谱对比信号。与正常淋巴管相比，瘤周淋巴管的平均血管直径更大，可能是增生造成的。皮下注射PEG-GNBP-II后，观察到到不仅在瘤周淋巴管，而且在肿瘤内部都可以看到阴性的光谱对比信号，表明GNBP-II已渗入肿瘤淋巴管。横断面复合图像显示，GNBP-II出现在皮肤表面以下50和160 μ m的浅表和深部肿瘤淋巴管中。浅表淋巴管可能与黑色素瘤周围真皮组织中的淋巴管相对应。然而，位于皮肤表面以下160 μ m的淋巴管对应于肿瘤淋巴管。皮下注射GNBP-II后，肿瘤下游的瘤周淋巴管主要呈现负的光谱对比信号，可能是由于淋巴管清除导致这些淋巴管中GNBP-I的浓度降低。

GNBPs在黑色素瘤小鼠中追踪前哨淋巴结

为了进一步研究对比剂注射到两个不同盆的淋巴引流路径，在注射前和每次注射后对小鼠耳同侧颈深淋巴结进行了成像。注射前横断面复合图像上未见淋巴结淋巴管OCT信号。瘤内注射30分钟后，淋巴结内淋巴管可见阳性光谱对比信号。皮下注射30分钟后，在同一淋巴管中可以观察到阴性的光谱对比信号。结果表明，在瘤内和皮下注射后，GNBPs都被引流到瘤周淋巴管中，然后由颈深淋巴结收集。在对植入黑色素瘤的小鼠进行体内成像后，切除了同侧和对侧的颈部深部淋巴结，并进行了体外三维(3d)淋巴管造影。在3-D OCT淋巴管光谱图和横截面复合图像中，同侧颈淋巴结淋巴管中可见光谱对比信号，但在小鼠对侧淋巴结中看不到。同侧颈淋巴结的淋巴管网络和淋巴滤泡在三维光谱增强OCT淋巴管造影中清晰可见。结果表明，使用造影剂GNBPs追踪了黑色素瘤中的前哨淋巴结。

综上，研究团队开发了光谱可识别的OCT造影剂- GNBP，并证明了PEG-GNBP可用于活体动物NIR-II的多重成像。在淋巴研究领域，该技术可用于异质肿瘤细胞的淋巴结转移成像，也可用于分子成像研究各种淋巴内皮细胞受体在肿瘤血管生成性淋巴管和淋巴结中的动态表达。通过将该技术应用于体内脑成像，相信它可以进一步揭示在神经元炎症和神经退行性疾病中起重要作用的脑淋巴引流通路的奥秘和复杂性。