2024年8月2日，Science Immunology期刊上，来自比利时列日大学的研究人员发表论文标题为“Recruited atypical Ly6G+ macrophages license alveolar regeneration after lung injury”。新发现巨噬细胞群体：Ly6G阳性非典型巨噬细胞，这是一种重要的先天性免疫细胞，在呼吸道病毒造成损伤后会定植于肺部中。这些巨噬细胞在修复肺泡方面发挥着重要作用。这一突破性发现有望改变我们对感染后免疫反应的认识，并为新的再生疗法打开大门。

Ruscitti C等人在2024年7月Sci Immunol.上发表的文章中，推测招募的巨噬细胞的某些亚群可能在组织修复和再生中发挥有益作用，将重点放在 IAV 诱导的肺损伤背景下研究先前未描述的表达Ly6G（一种通常与中性粒细胞相关的标志物）的巨噬细胞群。

Abstract

The lung is constantly exposed to airborne pathogens and particles that can cause alveolar damage. Hence, appropriate repair responses are essential for gas exchange and life. Here, we deciphered the spatiotemporal trajectory and function of an atypical population of macrophages after lung injury. Post-influenza A virus (IAV) infection, short-lived monocyte-derived Ly6G-expressing macrophages (Ly6G+ Macs) were recruited to the alveoli of lung perilesional areas. Ly6G+ Macs engulfed immune cells, exhibited a high metabolic potential, and clustered with alveolar type 2 epithelial cells (AT2s) in zones of active epithelial regeneration. Ly6G+ Macs were partially dependent on granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-4 receptor signaling and were essential for AT2-dependent alveolar regeneration. Similar macrophages were recruited in other models of injury and in the airspaces of lungs from patients with suspected pneumonia. This study identifies perilesional alveolar Ly6G+ Macs as a spatially restricted, short-lived macrophage subset promoting epithelial regeneration postinjury, thus representing an attractive therapeutic target for treating lung damage.

材料方法

1、动物模型及样品制备：

•8-12周龄 C57BL/6 野生型小鼠经鼻感染 5pfu 的 IAV H1N1 毒株PR8/34。•在感染后的不同时间点（第0、5、10、15和20天），收获肺并处理成单细胞混悬液。•裂解红细胞，并通过70 μm细胞过滤器过滤细胞。

2、流式检测的细胞群体：

•中性粒细胞 (Ly6G + CD11b + CD64-)•肺泡巨噬细胞 (Ly6G-CD64 + SiglecF + CD11c +)•单核细胞（CD64-Ly6C-和CD64-Ly6C +）•炎性单核细胞 (CD64 + Ly6C +)•间质巨噬细胞样细胞 (F4/80 + CD11b + Ly6G-SiglecF-Ly6C-CD64 +)•Ly6G+ 巨噬细胞 (Ly6G + CD11b + CD64 +)

3、细胞内染色：

•为了检测精氨酸酶-1和骨桥蛋白，首先对细胞进行表面标记染色，然后固定并破膜，使用抗精氨酸酶-1和骨桥蛋白的抗体进行细胞内染色。

4、增殖试验：

•Ki67 染色：固定细胞，进行破膜处理，并用抗 Ki67 抗体染色以评估增殖。•EdU 掺入：分析前4小时小鼠注射EdU。处理细胞进行表面染色，然后固定，透化，并使用基于点击化学的检测试剂盒进行 EdU 染色。

同时结合了其它技术，包括单细胞 RNA 测序、细胞离心涂片和 Giemsa 染色形态学分析以及骨髓嵌合体实验。

实验结果

1、流式细胞术分析可发现IAV感染后髓系细胞群的时间动态变化：

•中性粒细胞在感染后第5天达到峰值，到第15天恢复至基线水平。•肺泡巨噬细胞在第5-10天期间数量部分减少，到第15天时恢复。•经典和炎性单核细胞约在第5天达到峰值。•间质巨噬细胞样细胞数量随时间逐渐增加。•Ly6G+巨噬细胞从第5天开始出现，第10天达到峰值，并持续存在至少到第20天。

以下是IAV感染后髓系细胞动态变化的简化图示：

这个图表展示了通过流式细胞术分析得到的不同髓系细胞群的时间动态变化。值得注意的是，Ly6G+巨噬细胞在恢复期（第10-20天）出现并持续存在，这一现象暗示它们可能在组织修复和再生过程中发挥重要作用。

2、Ly6G+巨噬细胞的表型特征：

•表达F4/80高、SiglecF低、CD11c低•高表达CXCR4、MHC-II、CD101和CD319•低表达中性粒细胞活化标志物CD177

3、形态学特征，通过离心涂片和吉姆萨染色观察，Ly6G+巨噬细胞呈现以下特点：

•肾形细胞核（类似炎性单核细胞）•细胞质中含有大量空泡状结构•细胞膜富含突起

4、转录组特征，单细胞RNA测序识别出一个不同的Ly6G+巨噬细胞群，其特征是高表达：

•组织蛋白酶（Ctsb、Ctsz）•半乳糖凝集素（Lgals1、Lgals3）•精氨酸酶-1（Arg1）•骨桥蛋白（Spp1）

5、来源和增殖特性：

•EdU掺入实验和Ki67染色表明Ly6G+巨噬细胞不处于活跃增殖状态。•使用Ms4a3CreR26LSLtdTomato和Cx3cr1GFP报告基因小鼠进行的谱系追踪实验显示，Ly6G+巨噬细胞源自募集的单核细胞，而非局部祖细胞。

6、发育轨迹：

•对单细胞RNA测序数据进行Slingshot轨迹分析表明，Ly6G+巨噬细胞是由Ly6C+单核细胞经过中间炎性单核细胞阶段分化而来。

7、功能意义：Ly6G+巨噬细胞在促进肺损伤后的肺泡再生中发挥重要作用。