Skin-on-a-Chip：Transepithelial Electrical Resistance

And Extracellular Acidification Measurements

Through an Automated Air-Liquid Interface

皮肤是人体重要的器官，在保护人体内部器面起着至关重要的作用。因此，人们进行了大量的工作来创建人造表皮模型进行体外皮肤毒性试验。这些组织模型被称为重建人表皮细胞模型（reconstructed human epidermis，RhE），被用于在制药、化妆品和环境领域中评估皮肤暴露于外源性物质中的毒性研究。在这里，我们提出了一个无标记的方法，即利用了intelligent lab for in vitro diagnostics（IMOLA-IVD）一个无创、基于传感器的平台，来检测多孔膜上RhE细胞模型和贴壁细胞的跨上皮细胞层电阻（transepithelial electrical resistance，TEER）。首先在聚碳酸酯膜上培养小鼠成纤维细胞作为测试模型，使用定制的生物芯片封闭式设计，以及双微流道结构，用于培养物的连续和自动灌流。检测L929细胞的胞外酸化率（Extracellular acidification rate，EAR）和跨上皮细胞层电阻（transepithelia lelectrical resistance，TEER）。通过该平台监测RhE细胞模型的TEER超过48小时。TEER和EAR测试表明，该平台可以长时间稳定培养芯片上的皮肤细胞模型，监测代谢参数，以及组织降解。        

Keywords：TEER；Organ-on-a-Chip；skin models；reconstructed human epidermis；impedance；label-free monitoring

1.       INTRODUCTION

作为人体最大的器官，皮肤代表着人体内部和外部环境之间的结构学屏障，将体内器官与毒素、病原体隔离开来，并保护内部器官免受紫外线（UV）辐射。除了重要的屏障功能，人体皮肤还执行人体的几个基本功能，如热调节、感觉和排泄。因为皮肤是人类抵御外部环境的影响的第一防护罩，新的化学物质的研究，如药物和毒素，必须分析和评估其对调节皮肤完整性的能力。调查在这些化合物的影响下，细胞生物学利用细胞培养模型，更深入的研究了解由化学物质调节的细胞行为。在过去的十年里，科学家开发了各种生物工程模型用于皮肤毒性研究。第一个皮肤模型基于传统的二维（2D）共培养模型，角质细胞接种到培养好的成纤维细胞上。由于在刚性塑料上培养不能长时间维持上皮细胞，而且阻止了细胞分层，组织工程界开发了3D皮肤模型来再现体内类似结构，并通过整合气液界面设计了一个更具有生理相关性的环境。

人的皮肤由下列初级层组成，它们具有附属的功能：表皮层、真皮层和皮下组织。将不同皮肤层整合到细胞模型中，目前的皮肤模型可分为含角质细胞的重建人表皮模型、含角质细胞和成纤维细胞的代表真皮和表皮隔层的全层模型，以及带有额外细胞类型（如黑素细胞、干细胞等）的全层模型。由于其结构简化，重新建立人表皮（RhE）模型具有较高的重现性，因而被广泛接受。RhE细胞模型由人源性角质细胞接种在聚碳酸酯半透膜上，并将其纳入细胞培养系统，置于标准孔板中，如商业化的Transwell®系统（Corning Inc.，Corning，NY，USA）。该装置将培养物放置在气液界面，皮肤表面暴露在空气中，形成生理环境类似的培养条件。目前，有开放的皮肤模型，以及商业的模型，如EpiDerm™（MatTek in vitro life science laboratories, Bratislava, Slovak Republic），EpiSkin™（EpiSkin, Lyon Cedex, France），SkinEthic™（EpiSkin），EpiCS®（CellSystemsGmbH，Troisdorf，Germany），和LabCyte（Japan Tissue Engineering Co., Ltd. [J-TEC], Aichi, Japan）。ALEXANDRA协会遵循非营利性的方法，为制作和测试开放的3D皮肤模型提供了方案。

2. Background

2.1. 基于重构人表皮的皮肤毒性试验的最新进展

从监管角度来看，评价和预测有毒化合物和药物对皮肤的有害影响，3D模型系统必须经过一系列广泛测试化合物的验证。如果通过欧洲替代方法验证中心 （ECVAM） 证实和经济合作与发展组织（OECD）测试指南（TG），具有测试技术的模型就可以作为可接受的工具用于皮肤毒性测试。到目前为止，OECD提供了用于皮肤腐蚀和刺激的指南测试的指南，分别基于OECD TG 431和439。

2.2.器官芯片平台和微生理测量

由于目前的模型在生物学的相关性上，只提供有限的意义，所以毒理学领域测试正朝着实现器官芯片（Organ-on-Chip，OOC）仪器的方向发展。器官芯片系统描述了一种包含灌注小室的微流体细胞培养装置，在生理相关条件下培养活细胞。然而，大多数OOC平台仍然严重依赖端点分析方法，缺乏的不同时间点的测试方法。此外，化学标签，如荧光标签可能会潜在地影响细胞代谢从而改变实验结果。因此，采用无标签技术的实时读数的集成设备，对于测量进行空间和时间解析的是非常有意义的。

２.３. 皮肤/重建人表皮的跨上皮细胞层电阻

由于潜在的有害化合物会影响皮肤厚度，厚度的测量也是早期研究的参数之一。破坏性测量，例如活组织检查，或非破坏性测量，如共焦拉曼光谱仪和超声波成像。其中方法和有用的细胞培养的应用就是测量皮肤通透性屏障，以评估上皮或内皮组织的活力和功能。在这里，跨上皮细胞层电阻（TEER）提供了一种无标记和快速的技术来研究皮肤完整性。TEER值代表了一层或几层细胞层的电阻值。

２.４. 目前跨上皮细胞层电阻测量的缺点和跨上皮细胞层电阻自动化测量的需要

除了微加工方法，还有一些商业上可用的外部测试系统，如“伏特-欧姆计”（World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA）,，它可以现成的。由于缺少与细胞培养系统的整合，研究人员需要手动将细胞培养物从生物培养箱放到测量系统。这个过程缺乏重现性和标准化，也不能提供高通量测量的能力。虽然下一代的电极室（如Endohm室）可以直接测量，但是培养基以及试剂都必须手动加入，用于长期培养和药物研究案例。因此，扩展的研究是不可能的，因为旧的介质不能从培养系统中取出，也没有自动灌注新鲜的培养基。总而言之，目前的TEER测量系统仍然严重依赖手动操作和手持式系统，影响了测量的稳定性，从而影响了整体实验的再现性。经济合作与发展组织（OECD）认为，一个可接受的测试方案，分析重现性是验证中的一个基本标准。因此，TEER领域通过集成自动TEER监控和采集，系统能够在培养基频繁变化的情况下执行编程模式测量，也非常有意义。

在此，我们介绍了一种新的自动监测测试和采集数据的微生理测量系统（IMOLA-IVD，德国cellasys）用于TEER测量。通过一个密封设计的商业化，用聚碳酸酯膜培养的表皮细胞RhE细胞模型。应用TEER测量用于研究RhE培养，并集成到自动化的流体平台，可以精确灌注培养基和加药。此外，我们能够监测细胞外酸化率（extracellular acidification rate， EAR）。实证研究的目的是通过集成自动化灌流系统和集成测试平台，实现实时动力学测量，同时保证测量稳定性。本研究演示了一种评估皮肤完整性的无创的测量方法的验证和应用。

3．Materials and Methods

3.1. 体外诊断智能移动实验室概述  

IMOLA-IVD是一种芯片上的实验室测量系统，用于自动监测L929小鼠成纤维细胞和EpiDerm™重建人表皮细胞模型的TEER和EAR。IMOLA-IVD的基本操作已经在之前的工作中进行了描述，简单地说，每个IMOLA-IVD包括一个电源、模拟和数字模块，以及一个集成了传感器的生物芯片，该传感器被动地监测细胞模型的微环境。标准的IMOLA-IVD实验是通过装载数据采集和链接应用DALiA 2.0软件的个人计算机实现自动化的，以控制一个蠕动泵和连接6个IMOLA-IVD系统的微流控通路。泵在ON和OFF状态之间循环。在OFF泵关闭周期，细胞能够代谢培养基中的营养物质；在ON泵打开周期，营养丰富的培养基被灌流到细胞中。

3.2 改进的BioChip-D小室

生物芯片模块包含一个传感器芯片连接到电路板并连接到一个圆柱形密封小室，用以保护芯片的连接并连通细胞及培养基。一个流体头直接连接密封小室，形成一个液体密封、静态微容积（~ 6μL）的反应室，在集成的传感器表面测量细胞外酸化率（EAR）和氧合作用 （图1a）。然而，需要测量RhE的情况下，多孔膜上培养的细胞不适合标准生物芯片或标准的IMOLA-IVD叉指电极传感器（IDES）测量电阻。为了克服这些限制，新的密封小室和流体头的设计，以保持空气-液体使用Pro/Engineer Wildfire 4.0 （PTC Inc., Needham, MA, USA）。密封用Ultimaker 2 （Ultimaker BV，Geldermalsen，Netherlands），使用聚乳酸（PLA）和硅橡胶医用粘合剂（Corning Inc., New York, NY, USA）连接到生物芯片BioChip。重新设计的BioChip小室适用于扩大培养室和其他多孔膜上培养的细胞（图1b）的RhE。

3.3. L929细胞与重建人表皮细胞的制备与培养

记录小鼠成纤维细胞（L929）和重建人表皮细胞（RhE）的跨上皮细胞层电阻值。L929细胞在加10%胎牛血清（FBS） 和10 μg/ml gentamycin （Thermo Fisher,Waltham, MA, USA）。细胞按照标准的实验室规范（GLP）培养，并保存于37℃和5%的培养箱中培养后，在95%融合度时，细胞传代，100,000细胞种在12mm Transwell®上，孔径3 μm的多孔膜（Corning Inc.）。transwell随后被放置在6孔板上，并在1ml DMEM中再孵育24小时，然后转移到modified BioChip中。L929细胞是我们实验室的标准细胞系，用于验证实验。

将EpiDerm™RhE细胞模型转移到6孔板上，并在5.5mm/5mL的MatTek无血清长期培养基（#EPI-100-NMM-250） （MatTek in vitro life science laboratories）。每48小时交换一次培养基，直到转移到BioChips中TEER实验。实验开始前24 h，将培养基减少到0.9 mL然后放在12孔板里。Modified BioChip-D在70%乙醇中室温灭菌处理20 min后，用无菌去离子水冲洗。生物芯片灌流无缓冲DMEM处理24 h以稳定温度，然后将膜培养物放置在芯片上。

3.4. 自动化灌流系统的介绍

设计了一种自动灌流系统来自动化监测在生物芯片上培养48小时以上的RhE细胞模型的TEER。该系统由两个流体模块（FM）组成，通过与Tygon® E-3603 （ProLiquid GmbH, Ueberlingen, Germany）管道连接成独立的管道。这些独立的网络通过IMOLA-IVD泵标准设置的ON/OFF开关程序，向基底细胞提供营养丰富的细胞培养基，并定期向Transwell®膜的顶部区域，泵入磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）。如图2所示。培养基流入模块在无缓冲的DMEM和0.2%SDS的培养基之间切换，提供给膜底部的细胞。TEER测量模块连接到PBS进行TEER测量或测试可用于接种RhE表面的水溶性测试物。

L929细胞培养在多孔膜小室上，RhE细胞模型培养在Modified BioChip-D上，通过无缓冲的DMEM与灌流泵进行36小时周期的培养。对于L929细胞，为监测细胞酸化，泵ON时间为5分钟，而泵OFF时间为5分钟、10分钟、30分钟和55分钟。对于RhE细胞模型，泵周期为5分钟ON, 10分钟OFF, 5分钟ON, 25分钟OFF, 5分钟ON, 10分钟OFF。在25分钟的泵OFF阶段，通过将PBS泵入膜顶部小室，在芯片上的电阻传感器和流体头部的导线电极之间建立电路连接，记录TEER测量。以60 μL/min的速度将750 μL的PBS泵到芯片上的膜上，然后以120μL/min的速度去除。TEER测量是在25分钟泵关闭期间进行的。在预定的稳定测量周期后（L929细胞和RhE细胞模型分别为47和36小时），将0.2% SDS无缓冲DMEM泵入芯片作为阳性对照。用SDS培养基灌注至少12小时，以证实对照组对测得的TEER的影响。

4. Results and Discussion

4.1. 重新设计的经上皮电阻密封功能

将多孔膜插入培养室，确定培养室体积为~170 μL。匹配样机通过膜下形成的入口孔灌注到腔内，膜底部的孔允许新鲜营养物质被动地扩散到细胞的基底层和细胞的废物扩散出细胞。在泵ON循环期间，营养消耗后的培养基泵出腔室（图2）。RhE培养物的顶端表面暴露于环境空气中，经过长时间的培养，刺激分化成一个ALI的分层。为了测量这些培养物的TEER，重新设计的流体头包含一个双向的入口/出口阀，周期性地分配一定量的PBS溶液。这种方法连接多孔膜顶端腔的导线电极（见图1b）和传感器芯片上的平面IDES电极之间的电路。溢流阀使TEER电极淹没在稳定的培养基体积中，防止溢流。连续5分钟记录膜的TEER，然后在测量之后取出PBS以维持ALI。

4.2. 小鼠成纤维细胞的胞外酸化率的测定

使用自动测量程序实时测量EAR，将L929细胞生长在聚碳酸酯膜。用未缓冲的DMEM以50 μL/min的速率灌注L929细胞。图3显示了在泵交替阶段测量的pH值（以mV为单位）。红色条表示泵OFF阶段，灌流新鲜培养基，细胞活跃地将营养物质代谢为酸性废物，生物芯片上的金属氧化物传感器会检测到这些代谢物。绿色条表示泵ON阶段。在此阶段中，膜底部灌注新鲜培养基，提供营养给膜上培养的细胞。从图中可以看出，当培养基酸化时，泵OFF阶段55分钟内，电压会增加~5 mV，而较短的时间内不会产生明显的电压变化。

4.3. 小鼠成纤维细胞对十二烷基硫酸钠培养基的代谢反应

一旦泵ON周期结束，测量的电压迅速下降，直到达到基线（稳态）值。在下降之前存在一个短暂的延迟，这可能是由于新鲜培养基与芯片上已有的酸化培养基之间的混合导致的，因为出口的位置高于进口。在58小时，测量的信号下降。这可能是由于细胞膜破裂和细胞内内容物释放到培养基中。在56小时，细胞已经溶解，因此不会产生废物酸化周围的介质，导致在55分钟泵OFF阶段信号变平坦。图4描述了在实验持续时间55分钟OFF阶段持续测量EAR。可以看出，加入SDS后，EAR突增，然后迅速降至零以下，表明细胞裂解。然后它逐渐趋近于零，直到实验结束。

4.4. 小鼠成纤维细胞的TEER（跨上皮细胞层电阻）监测

除了监测L929细胞的代谢率，在25分钟泵OFF期间还可以监测TEER值。在TEER测量过程中，随着PBS泵入测量小室以连接电路进行测量，数值会发生变化。TEER开始无数值，因为电极对之间存在断路。嵌入在流体头的导线电极浸入PBS中，与膜下的芯片上的导电电极一起连接形成电路。PBS在细胞上停留5分钟，泵OFF以进行稳定监测。然后PBS被泵出测量小室，直到下一个测量循环。

图4显示了从25小时开始测量的EAR和TEER。在泵OFF阶段，EAR由线性回归计算。表1总结了SDS加入前和加入后的结果。实验开始24小时后，实测的实数电阻稳定在190欧姆附近，虚部电阻为-40欧姆。因为已知L929小鼠成纤维细胞在培养中保持单层，预计电阻将稳定在一个低水平。暴露于0.2% SDS培养基8小时后（时间为第 56小时），实数电阻下降14.8%，对应加入SDS导致的细胞死亡。虚部电阻下降6.11%。这些结果表明，开发的密封设计和泵模块能够进行自动化电阻测量。

4.4. RhE细胞模型的TEER（跨上皮细胞层电阻）监测

使用上述相同的设置对重建人表皮细胞模型（reconstructed human epidermis，RhE）进行连续监测TEER约50小时。在前12小时，TEER值保持相对稳定，如图5所示。在36小时后，用0.2% SDS处理细胞后2小时，平均TEER值突然下降。（b）SDS培养基加入前，TEER值最初是直线增加的，在用PBS加入顶端腔后，然后迅速稳定并保持，直到5分钟的测量周期结束。当从上部小室中移除培养基后，由于电路短路，TEER再次变成无数值。

在换到SDS培养基2小时后，TEER曲线的变化就可以被检测到。起初，TEER值与加入SDS培养基前相同。但是TEER值在测量期间稳步下降，直到稳定在一个更低的值。这导致测得的平均TEER降低，这与加入SDS引起的细胞裂解吻合。此外，随着SDS培养基加入时间的增加，电阻的初始峰幅值减小。尽管暴露于SDS，最初的峰值的持续似乎表明细胞存活。值得注意的是，以前的IMOLA-IVD研究是在简单的单层细胞上进行的，相对较低浓度的0.2% SDS就可以较短的时间内杀死细胞。而更加严重细胞裂解过程相对缓慢可能归因于更复杂的3D皮肤模型中培养的细胞的生命力的增强。

5. Conclusions

在这里，我们提出了一种创新的方法，以非侵入性监测细胞培养在二维和三维多孔膜在各种形态。生物芯片密封设计被证明支持小鼠成纤维细胞的单层，以及更复杂的重建人表皮细胞模型（reconstructed human epidermis，RhE）。此外，设计了一个两部分的自动化流体系统，处理将PBS溶液输送和加入到顶部腔室进行TEER测量。使用L929细胞，设计了一个标准的操作方法，通过定期测量TEER来监测代谢率和屏障完整性。SDS培养基加入之前保持的细胞活力，作为阳性对照。

在用L929细胞进行初步试验后，对重建人表皮细胞模型的TEER进行监测。TEER值显示皮肤模型可以培养至少24小时，加入SDS培养基后的细胞裂解也会延迟。在以后的实验中可以使用更高的SDS浓度来提高对照的响应时间。总的来说，这项工作是一项概念验证实验，证明了IMOLA-IVD用于复杂3D组织模型的能力，作为非侵入式自动化细胞分析的工具。值得注意的是，这项工作还提出了一个维持ALI的自动TEER测量的方法。