新西兰胎牛血清(SFBS)

产品名称：新西兰胎牛血清

货号：SFBS

规格：500ml

品牌：BOVOGEN

细胞培养最基本的是做好污染防控，包括微生物污染的防控和细胞系间交叉污染的防控。

实验中需保持良好的操作习惯，所用材料的位置摆放要顺手，污染源和已灭菌物品要分开放置。实验室也需定期清洁与消毒。

※血清与培养基

通常血清的添加比例为10%，当然也可根据细胞状态和生长速率适当增加或减少添加比例。在更换血清品牌或者批次时，最好需对血清的品质进行验证，防止对实验造成影响。

对于培养基，目前商品化的比较成熟，稳定性也较好。如若需自配培养基时，过滤前搅拌时间不宜过长（培养基中营养丰富，细菌常温下20min就可繁殖一代，其代谢产物会对培养基的品质产生影响）。培养基过滤除菌后，应对培养基进行无菌验证，防止污染。

※细胞培养瓶

目前商品化的细胞培养瓶主要为瓶盖是否带气孔两种。其中不带透气孔细胞培养瓶拧紧后需适当回旋瓶盖，保证CO2能顺利进入细胞培养瓶。

细胞培养过程中，对于适应能力强的肿瘤细胞，可在传代3-4次后更换新的细胞培养瓶。对于非肿瘤细胞系如293T，HEK293等细胞，建议每次传代更换新的细胞培养瓶来保证细胞状态。

※细胞传代

正常细胞形态较好，轮廓清晰，边缘透亮，细胞增殖状况良好。当贴壁细胞长到密度90%时，需进行传代。

传代时通常使用胰酶消化法。该方法又分为干消化法和湿消化法。

干消化法：胰酶浸润后弃去胰酶，待细胞变圆后加入新鲜培养基吹下后再进行细胞传代。

湿消化法：待细胞变圆，肉眼观察下成流沙状脱落时即可加入新鲜培养基终止消化，1000rpm离心5min,弃去上清，用新鲜培养基重悬传代。

吹打细胞时，手法要轻柔，避免吹打出气泡，造成细胞因内外压差破裂，同时需避免刮到瓶壁影响细胞的贴壁。

不同细胞的贴壁能力不同，消化时间不同；不同细胞细胞间连接强度不一样，消化时间不同；同一细胞生长状状况不同，消化时间不同。消化时适时观察细胞形态，避免因过度消化影响细胞活性。

传代间隔时间和传代比例因细胞而异。细胞传代过程中，当细胞出现状态不好或者污染时及时弃去细胞，重新复苏。

※细胞冻存与复苏

当细胞生长状况较好或者代数较早时，需及时大量的冻存。

细胞冻存液比例为培养基：血清：DMSO=7:2:1，也可血清：DMSO=9:1。细胞冻存密度通常为1-3×106个/ml。细胞冻存采用慢冻方式，减少冰晶形成，避免细胞损伤。通常4℃放置0.5 h，-20℃放置2 h，-80℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

细胞复苏时升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。38℃水浴不时摇动，在1分钟内使其*融化，1000rpm离心5min,弃去上清，用新鲜培养基重悬移入培养瓶中。

※用真诚感动细胞

俗话说，心诚则灵。对待细胞培养也应如此，“自己要用的细胞自己养”，多去观察细胞生长状态。

所谓“知彼知己，百战不殆”。培养细胞需要我们的耐心以及不断的摸索和积累，了解了每种细胞各自的习性后，再“傲娇”的细胞也能在我们的“真诚”下认真“成长”※※※※

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贴壁细胞传代：

1）移弃使用过的细胞培养液。（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染）

2）使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。（洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培养瓶为例，向瓶内加入1ml胰蛋白酶-EDTA（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，几分钟内，会发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流下，此时应加入2-3ml含血清的*培养液终止消化（细胞解离所需时间请参考各细胞的指引，并建议每隔30秒在显微镜下观察细胞的解离情况）。另外，并不是所有贴壁细胞都适用采用胰蛋白酶进行解离，请根据各细胞的指引选择合适的解离方法。

4）使培养瓶倾斜，吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面，重复该动作2-3次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应避免气泡的产生）。

PS：对于难消化的细胞，尽量不要通过用力吹打的方式来处理，以免对细胞产生物理损伤。可以先将已经消化的细胞分出来，及时终止消化。然后再对仍然贴壁的细胞进行再次消化。做到分层消化，避免易消化细胞长时间在胰酶消化下受损。

5）把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后移弃上清。

6）加入新的含血清*培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新的含血清*培养液，轻轻摇晃混匀。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况。

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9、如何区分活细胞和死细胞?

显微镜下观察：活细胞中间透亮，饱满，有光泽，死细胞较暗。也可以通过台盼蓝染色来计算细胞活力。

10、如何用台盼兰计数活细胞?

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000 个/毫升，在0.1 毫升的细胞悬液中加入0.1 毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞，注意计数需在加入台盼蓝10min内完成。有细胞计数仪的，可直接用计数仪进行。

11、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。

12、使用胰蛋白酶加入EDTA是为什么?

EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

13、可否使用与原先不同的培养基?

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，易造成细胞状态不好，最终造成细胞无法存活。

14、可否使用与原先不同的血清种类?

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

15、细胞为何生长不均匀?

细胞传代后放入培养箱没有摇匀，或者放入时摇匀，但在细胞贴壁前，又移动了培养瓶，频繁开关培养箱引起的振动或者培养瓶中培养液过少，培养箱搁板表面不平整，这些因素会导致细胞生长不均匀。

16、购买的细胞死亡或细胞存活率不佳

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。运输过程对细胞有严重影响。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C太久。

人卵巢癌细胞荧光素酶标记 SK-OV-3+LUC

人肝癌细胞 smmc-7721

人脑胶质瘤 SNB-19

人肝癌细胞 snu-1

人肝癌细胞 Snu-182

人膀胱上皮永生化细胞 sv-huc-1

人滑膜肉瘤细胞 SW982 [SW-982]

人结肠腺癌细胞 SW1116

人肾上腺皮质小细胞癌细胞 SW-13

人肾上腺皮质小细胞癌细胞 SW1353

人胰腺癌细胞 SW1990

人结肠腺癌细胞 SW480

人甲状腺癌细胞 SW579

人结直肠腺癌细胞 SW620

人结直肠腺癌细胞+GFP SW620+GFP

人结直肠癌细胞氟尿嘧啶耐药株 SW620/5FU

人膀胱移行细胞癌 SW780

人膀胱移行细胞癌细胞 T24

人乳腺导管癌细胞 T47D

人胶质母细胞瘤 T98G

人食管癌细胞 TE-1

人食管癌细胞 TE-12

人单核细胞白血病细胞 thp-1

人脑胶质瘤 TJ905

人乳头状甲状腺癌细胞株 TPC-1

人甲状腺癌细胞 TT

人喉癌细胞 TU212

人喉癌细胞 TU-138

人脑星形胶质母细胞瘤 U118MG（U-118MG）

人成骨肉瘤细胞 U-2 OS

人类星形胶质细胞瘤细胞 U251 MG (KO)

人类星形胶质瘤耐替莫唑胺细胞 U251 MG/TMZ

人类星形胶质瘤耐替莫唑胺细胞荧光素酶标记 U251 MG/TMZ+LUC(3000)

人骨髓瘤细胞 U266

人脑星形胶质母细胞瘤 U87MG

人脑星形胶质母细胞瘤+RFP U87MG+RFP

人淋巴瘤细胞 U-937

人膀胱移行细胞癌 UM-UC-3

人前列腺癌细胞 VCAP

人视网膜神经胶质瘤细胞 WERI-RB-1

人黑素瘤细胞 WM-115

人正常前列腺基质永生化细胞 WPMY-1

人正常肝细胞 WRL68

云南宣威人肺腺癌细胞系+GFP XWLC-05+GFP

人胆囊癌细胞系 ZJU-0430

人胆囊癌细胞系荧光素酶标记 ZJU-0430+LUC

人乳腺癌细胞 ZR-75-1

17、细胞抱团怎么处理?

一些悬浮细胞抱团生长是正常现象，大部分悬浮细胞在细胞密度很高的情况下，很可能会出现部分细胞抱团生长的现象，聚团细胞很容易死亡并演化成絮状物，殃及周围的悬浮细胞，因此在培养悬浮细胞时需控制好细胞密度。如果出现了细胞团，可以通过细胞筛去掉部分较大的细胞团，也可以尝试一下方法：将细胞悬液收集到15 ml离心管中，静置20 min左右，小心取上层细胞上清培养(该方法只能去除部分较大的细胞团)。

18、细胞内有空泡，是否是正常现象?

部分细胞本身存在一定的空泡(如HepG2，Ishikawa及一些耐药株等)，这个是正常现象。如果只有少数细胞有内出现极少空泡，则很可能是细胞状态不佳，可以通过调整血清浓度，控制消化，控制传代比例及时间等方法来调整细胞状态;如果大部分细胞出现空泡，且单个细胞内空泡数目偏多，则可能细胞代次较高，细胞老化所致，需更换代次较早的细胞。

19、细胞传两代后开始逐渐死亡的原因

很可能是培养体系不适合细胞(未使用推荐的培养体系);或者消化过度，对细胞有严重影响;或者是传代比例不合适(具有密度依赖性的细胞，传代太稀;或者生长较快的细胞，传代较密，细胞严重堆叠生长)。

20、细胞生长逐渐变慢是什么原因?

细胞增殖变慢有以下原因：1. 消化过度 2. 传代过密 3.细胞营养不良 4.细胞频繁传代 5.细胞状态不佳或老化 6.细胞存在污染。

21、培养细胞时应使用5%或10%CO2?

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2;当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。

22、CO2培养箱之水盘如何保持清洁?

定期(每周一次)更换水盘里面的水，水盘的水必须使用无菌蒸馏水或无菌去离子，水盘中可添加1%硫酸铜以预防霉菌污染。

23、细胞接种密度多少合适?

依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的一个重要原因。按照我们的经验：一般倍增时间24 h内的细胞，传代比率1:6-1:12为宜，倍增时间24-48 h的细胞，传代比率1:3-1:8为宜，倍增时间超过48h的细胞, 传代比率1:2-1:4为宜。

24、培养中常出现一些黑点，是污染吗?

首先肉眼观察培养液是否变浑浊，如果变浑浊，基本可以确定是污染;如果肉眼观察培养液没有变浑浊：在显微镜下观察黑点大小和形状是否规则，是否运动，是做布朗运动还是呈直线型快速移动。如果黑点大小不规则，做布朗运动，黑点可能是细胞碎片(可能是细胞状态不佳或者消化过度引起的)，也可能是血清反复冻融产生的蛋白沉淀引起的，也可能是细胞的代谢产物。如果黑点大小一致，快速移动，很可能是细菌污染。

25、如何预防细胞培养中黑点的产生?

掌握细胞传代的最佳时机，不要细胞长老了再传代;掌握好消化时间，防止消化过度产生细胞碎片;减少血清等试剂的冻融次数;将培养液的PH调到最佳;严格控制水质和器皿的清洁。

26、黑点已经产生了，如何进行处理?

如果判定黑点是污染，请及时将细胞处理后丢弃。其他情况，可参照以下进行：

如果是悬浮细胞：收集细胞上清慢速离心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更换新的培养瓶;如果是贴壁细胞：将细胞用PBS洗2-3遍，洗的时候，轻轻拍打培养瓶，让贴壁不牢的碎片和颗粒脱落，再弃去PBS，消化时先加低浓度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右，让细胞间隙中的颗粒和碎片脱落下来，去掉低浓度胰酶，然后正常消化细胞，将收集的细胞悬液慢速离心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更换新的培养瓶，并可以尝试适当增加血清浓度进行培养。

27、培养用dish,flask是否相同？

不同厂牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。

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