实时荧光定量PCR法进行无乳链球菌血清分型的实验步骤

B组链球菌(GBS) 是一种荧光检测带有包膜的革兰氏阳性菌，是新生儿侵袭性感染败血症和脑膜炎的重要原因，GBS血清抗体传统分型法通常需要经过乳胶凝集、多重 PCR 和条带大小分析或全基因组序列分析等步骤，过程繁琐，技术成本昂贵，所以在PCR实验室中采用实时荧光定量PCR 法进行血清分型不仅可以替代乳胶凝集法，还可以改进 GBS 血清型数据的采集。



GBS 细菌菌株分离与培养
将GBS 分离株在胰蛋白酶大豆 (TS) 或 5% 羊血琼脂平板上于37°C 培养，然后在 TS 培养基中于 37°C 培养过夜。

通过乳胶凝集进行血清分型
根据制造商的说明，使用 Immulex Latex Agglutination Streptococcus B 试剂盒（Staten Serum Institute；Copenhagen，Denmark）通过乳胶凝集对所有 GBS 分离株进行血清分型。简而言之，将 10 μl 乳胶试剂添加到悬浮在 10 μl 盐水中的单个 GBS 菌落中。如果 30 秒后可见凝集，则旋转反应并解释为阳性。 

实时荧光定量法 PCR 进行血清分型
设计引物和探针以扩增无乳链球菌每种血清型的多糖荚膜基因的区别区域。引物中的寡核苷酸未经修饰和脱盐，探针用荧光探针（5' 6-羧基荧光素 (6-FAM)）和两种猝灭剂标记，并通过高压液相色谱法纯化.

PCR实时荧光定量分析
使用 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 从 GBS 的过夜培养物中提取基因组 DNA。PCR 反应最终体积为 20 μl，由 10 μl Taqman Universal Mastermix、7.4 μl 无菌水、0.2 μl 正向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 反向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 探针（100 μM 储备液）和 2 μl GBS DNA（25 ng/μl）。在 荧光定量PCR仪器上进行三次反应，并进行软件分析。反应参数如下： 50°C 初始孵育 2 分钟；在 95 °C 下初始变性 10 分钟；在 95 °C 15 秒和 60 °C 1 分钟下进行 35 个 PCR 循环。阳性反应定义为循环阈值（CT ) < 30 对于 50 ng DNA 模板/反应。每次运行都包含阴性对照反应（无 DNA 模板）。实验结果与乳胶凝集进行比较。通过对比实验发现使用实时荧光定量 PCR 方案检测到预测序列，并且与任何其他血清型引物/探针组合没有阳性反应。而后通过乳胶凝法集确认了 47 株菌株的血清型，由此验证基于 PCR 的方法和乳胶凝集方法的血清分型结果无差异。
 实验方法对比
我们知道用于 GBS 血清分型技术的基于非核酸的实验室方法成本较高，并且需要高滴度的血清型特异性抗血清，并且会阻碍 GBS 血清型流行率的研究。而乳胶凝集试剂盒可若用于实验室的 GBS 血清分型，其价格也较贵。通过分子荚膜分型技术，包括多重 PCR   全基因组序列的靶向分析新可用的序列信息的适应性和相对容易的性能，但仅能分血清型 Ia、Ib 和 III 三种血清型。

   与许多现有方法不同，实时 PCR 法的血清分型不是基于操作员对生化反应的解释，它允许特异性鉴定 GBS 血清型，尽管会受到其他细菌 DNA 的干扰，但它可能在流行病学研究的背景下比较有用，作为现有多重 PCR 检测的替代方法。随着进一步的发展，这种新方法可以直接从标本中检测 GBS 血清型，而无需培养。这种方法基于实时 PCR 的血清分型虽然便捷，但检测由于需要特定的引物-探针组所以暂时无法直接识别新的血清型。

来源：苏州阿尔法生物实验器材有限公司