近些年来，随着PCR技术的出现，以及DNA克隆和测序方法的发展，对大量质粒载 体和重组子的需求也大大减少。
  在本方案中，通过 碱裂解法的放大（Birnboim and Doly 1979）,质粒DNA可从清亮的细菌裂解物中通过含有 漠化乙锭的CsCl梯度离心来进行纯化。
  无论是高拷贝数的质粒还是低拷贝数的质粒，通过这种方法可以得到每毫升3〜5^g 的DNA。重组子的质粒一般产量较少，这取决于克隆的DNA片段的大小和特点。
材料
为正确使用本方案中的器材和危险试剂，必须查阅相应的材料安全数据表并咨询所在机构的环境卫生和安全办公室。
储备溶液应稀释至适用浓度后使用。
试剂
琼脂糖凝胶（见步骤8和19）
碱裂解液I<A>
若用柱层析进一步纯化所制备的质粒DNA （见本章导言中"纯化DNA的商业试剂盒”部分），无菌的碱裂解 液I在使用前可补充适当体积的无DNA酶的RNA酶（20mg/mL,胰RNA酶），使终浓度为lOOpg/mL,若用其他 方法纯化DNA,不推荐在此步骤中加RNA酶。
碱裂解液II<A>
现配现用，室温使用。
碱裂解液III<A>
用于筛选质粒的抗生素
转化了目的质粒的细菌克隆
氯霉素（34mg/mL）（可选；见步骤4）
乙醇
异丙醇
溶菌酶（10mg/mL）
限制性内切核酸酶
培养基（LB、YT 或者 Terrific Broth） <A>,预热到 37°C
STE<A>,冰浴
TE （pH8.0） <A>
附加试剂
步骤8和步骤19需要第2章方案1中列出的试剂。步骤18需要柱层析所用材料（见 本章导言）。
设备
有盖的培养瓶（125mL, 2L）
知楚摇床，预设到37°C
RC6 Plus离心机带转头，合适容量（Thermo Scientific）
分光光度计
实验方法
细胞制备

• 挑取转化的细菌单菌落或用0.1〜l.OmL单菌落的培养物，接种到30mL含有适当 抗生素的培养基中（LB、YT或者Terrific Broth）o

为确保培养物通气良好：
・试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。试管盖要盖得松些。
•培养物要在剧烈振荡下培养。

• 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD6oo约为0.6）。

• 在含有500mL的LB、YT或者Terrific Broth培养液（预热到37°C ）及适当抗生素 的烧瓶（2L）中接种25mL对数生长期晚期的菌液。将此培养液在37°C剧烈振荡（300cycles/ min）,培养 2.5h»

最后菌液的ODao应为0.4。由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。

• 若质粒为低或中拷贝数的质粒，在培养液中加2.5mL浓度为34mg/mL的氯霉素， 使其终浓度为170ng/mLo

A对于高拷贝数质粒，不必添加氯霉素。

• 在 37°C 以 300cycles/min 振荡 12~16h。

• 取部分菌液（1〜2mL）到离心管中，4°C储存。2700g离心15min以收集余下的近 500mL培养物。弃上清，倒置离心管使残余上清流出。

• 用200mL冰预冷的STE重悬细菌沉淀，按步骤6所述重新收集细菌并储存在-20°C。

• 采用方案1中的方法或使用商品化试剂盒，从步骤6中取出的1〜2mL菌液中提取 质粒，并釆用酶切和琼脂糖电泳分析此少量制备的质粒DNA,以确定大量培养菌液中获得 的质粒正确。

设置这种对照可能看上去有点过于谨慎，然而它可以避免发生某些难以挽回的、浪费大量时间的错误。
细胞裂解

• 将步骤7中冻存的细菌在室温下放置5〜lOmin使其解冻，用18mL （10mL）碱裂 解液I重悬。

如果步骤4中使用了氯霉素的菌液，则使用括号中的体积数。
10. 加2mL （ImL）新配制的10mg/mL溶菌酶。

• 加40mL （20mL）新配制的碱裂解液II。盖上离心管盖，轻轻颠倒数次，混 匀，室温放置5~10min。

延长超螺旋DNA暴露于碱的时间会使其不可逆变性，所产生的环状卷曲DNA不能被限制酶切割，而且它在 琼脂糖电泳中的迁移率为正常超螺旋DNA的2倍，难以被漠化乙锭染色。从细菌中用碱裂解法提质粒时可能会看 到微量的这种DNA.

• 加20mL （15mL）冰浴冷的碱裂解液III。盖上离心管盖，轻轻地但振荡混匀 （此时不应再有两个液相）。将离心管在冰上放置lOmino

在放置过程中会出现由染色体DNA、高分子质量RNA,钾离子、SDS、蛋白质、细胞壁复合物一起形成的乳 白色沉淀。
在碱裂解液HI中最好使用乙酸钾而非乙酸钠，因为十二烷基乙酸钾盐比钠盐难溶•
13. 4°C用＞20 000g离心30min,让转子自动停止，无须制动。将上清轻轻移入量筒中， 弃去沉淀。
不能形成紧密沉淀的原因一般是加入碱裂解液II时没有充分混匀（步骤ID.如果细菌碎片不能形成紧密的 沉淀，以20 OOOg再次离心15min,将上清移入干净的离心管。转移时可用4层纱布过滤上清，可以除去黏稠的基 因组DNA和蛋白质沉淀。
质粒DNA回收

• 量取上清体积，将其连同0.6倍体积的异丙醇一起移入一支干净离心管中并将其 充分混匀，室温下放置lOmin。

15. 在室温下以12 OOOg离心15min回收核酸沉淀。
若在4莒离心会使盐沉淀下来。

• 小心弃去上清，将离心管敞开盖，倒置于纸巾除去残余上清。在室温下用70%乙 醇涮洗管壁，倒掉乙醇，并除去管壁的液滴。将离心管开口倒置于纸巾上使剩余乙醇挥发掉。

如果用干燥器或者真空干燥的方法干燥DNA沉淀，在某些情况下会使其难以溶解并可能变性（Svaren et al. 1987）.将沉淀在室温下干燥10~15min使乙醇挥发就足够，不会引起DNA脱水。

• 用3mL含有2.0卩g/mL无DNA酶的RNase A的TE （pH 8.0）溶解DNA沉淀。轻 柔振荡溶液。将DNA保存于-20°C O

18. 质粒DNA的纯化可用商业树脂进行柱层析（如QIAGEN公司的QIA-prep）。
19. 用DNA测序及限制性酶切结合凝胶电泳分析确证质粒结构。

疑难解答
问题（步骤19）：由于质粒毒性使质粒DNA得率低（W1.0卩g/mL）。

解决方案：换成低拷贝数的质粒或携带原核生物转录终止信号的载体。

问题（步骤19）：在酶切前、后经电泳只见很少或无DNA。
解决方案：在乙醇沉淀后，在步骤16中可能将核酸丢失。离心后马上小心地去除乙醇, 如果离心管放置的时间太长，DNA沉淀会与管壁分离。

问题（步骤19）： DNA不能被限制酶切割。
解决方案：DNA不能切割，可能是没有移去所有液体，在纯化质粒DNA的过程中， 有些成分阻碍限制酶的功能。可以尝试以下建议：

• 在步骤6中移去所有液体。

• 在步骤7中移去所有STEo

• 在步骤16中移去所有液体。

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