CHO细胞外泌体的分离和表征
时间：2023-02-03 阅读：945
CHO细胞外泌体的分离和表征
CHO 细胞是一种广泛用于生物制药蛋白质生产的宿主。 CHO 细胞中分离外泌体主要采用聚合物的沉淀 (PBP) 技术从分批培养中分离和富集细胞外泌体囊泡。分离后的外泌体可以通过多种方法来检测和表征分离的囊泡，这些分析包括动态光散射 (DLS) 和 Zeta 电位测量、电子显微镜 (EM) 和外泌体标记物分析、RNA 和脂质分析等。
一、细胞培养
1.培养基与细胞
细胞可使用CHO系中的CHO-S 细胞。
培养基使用 CD-CHO 培养基（ThermoFisher）。在培养基中添加 8 mM L-谷氨酰胺利于CHO细胞生长。
2. 培养：
培养物通常在锥形瓶中以 20 ml 分批培养模式在二氧化碳振荡培养箱中 37 °C 下以 120 rpm 摇动培养。细胞每 3-5 天传代一次，接种率为 0.2 × 10 6 个活细胞/ml。对于制备外来体制剂的分批培养，将细胞以 0.2 × 10 6 个活细胞/ml 接种在 20 ml 培养物中，然后在培养的第 3 天和第 5 天收获上清液。
3. 收获：
收获后的样本，细胞沉淀物和 5 个 3 × 10 6细胞沉淀物样品进行等分，用于细胞脂质和蛋白质分析。通过高速离心机以 2,000×g 离心 5 分钟沉淀细胞，并储存在 - 80 °C超低温冰箱中。所有剩余的培养物上清液都用于分离外泌体，如下所述。
二、通过聚合物沉淀法 (PBP) 制备外泌体
根据制造商的指南，使用 TEI 总外泌体分离试剂盒（Invitrogen）从培养基中分离外泌体。将细胞培养基以 2000× g离心30 分钟以去除细胞和任何碎片；随后将上清液小心移至离心管管中，加入 0.5 倍体积的 TEI 试剂，充分混合并在 4°C 下孵育过夜。然后将样品在 4°C 下以 10,000× g离心1 小时，然后在弃去上清液后，将富含外泌体的颗粒重新悬浮在 75 μl PBS 缓冲液中。然后将样品储存在 - 20°C 下，直到需要进行后续分析。
外泌体的表征分析
1.动态光散射
使用 Anton-Paar Lightsizer 500 粒子分析仪测定外泌体制剂中的粒度分布。动态光散射测量由于溶液中粒子的布朗运动引起的散射光强度的动态波动，（685 nm 的激光，检测角度为 15、90、175 度）；较小的粒子比较大的粒子移动得更快。
确定颗粒大小时，通常使用三种分布类型：
(1) 数量分布，报告不同大小“箱”中的颗粒数量；
(2) 体积分布报告不同尺寸类别的颗粒总体积；
(3) 强度分布，报告不同大小颗粒散射的光。
也可以使用高分辨率纳米粒径分析仪 Nanocoulter Ⅰ来分析样品中每种大小的囊泡的实际数量、浓度及粒子动态、Zeta 电位等。
为了进行分析，将先前储存在 - 20°C 的 75 μl 等分试样的外泌体制剂用 925 μl PBS 稀释（得到 1 ml）并转移到一次性比色皿中用于 DLS 测量。每个样品在 DLS 和 Zeta 电位实验中测量五次，如下所述。
2. Zeta 电位
通过电泳光散射 (ELS) 测量的 Zeta 电位测量粒子在电泳场中的速度。Zeta 电位是胶体分散体稳定性的指标（绝对值）和囊泡表面电荷的量度（+ 或 - 符号）。
3.电子显微镜分析
对于电子显微镜分析，外泌体制剂在 PBS 缓冲液中按 1:10 稀释，随后在等体积的 4% (w/v) 多聚甲醛和 1% (v/v) 戊二醛中固定 5 分钟。然后将样品置于 formvar-carbon 涂层的 600 目铜网格上，并在室温下干燥 5 分钟。随后将样品在乙酸双氧铀溶液（2% 水溶液）中进行对比，并在电子显微镜（Jeol1230 TEM）下观察，加速电压为 80 kV，并连接到数码相机进行观察 .
三、Bradford 分析法测定样品中的蛋白质含量
为了量化培养第 3 天和第 5 天的 CHO 细胞沉淀物和外来体制剂中的蛋白质含量，对细胞裂解物以及外来体裂解物和 75 μl 等分试样（每份均来自 1 ml 培养物）进行 Bradford 测定非裂解外泌体 。通过向细胞或外泌体制剂中添加先前描述的裂解缓冲液来制备裂解物。
1.SDS-PAGE 和蛋白质印迹
对裂解和未裂解的外泌体制剂以及分批培养第 3 天和第 5 天的细胞裂解物进行蛋白质印迹。所有样品均在还原（含有 β-巯基乙醇）或非还原 Laemmli 样品缓冲液中制备，在 95 °C 下煮沸 5 分钟，随后如前所述通过 12% SDS-PAGE 分离。每个蛋白质样品上样约 5 g。以下一抗用于已知外泌体标记物的蛋白质印迹；抗 CD63（Santa Cruz，sc-5275）、抗 CD81（Santa Cruz，sc-166029 和 sc-23962）和抗 TSG101（Santa Cruz，sc-136111）。
3. RNA分离和分析
从收获的第 3 天和第 5 天的 3 个外泌体样本中提取总 RNA。根据制造商的说明，使用总外泌体 RNA (TER) 和蛋白质分离试剂盒（Invitrogen）提取 RNA。从源自 1 ml 培养物的每个外泌体样品中洗脱出 30-35 μl RNA。然后使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计估计回收的 RNA 总量。
4.脂质分析
从 (a) 总细胞沉淀中提取脂质（1 × 10 6个活细胞，在第 3 天收获时含有 298.9 g 蛋白质，在第 5 天收获时含有 477.2 g 蛋白质），储存在 - 80 °C，和（ b) 从 7 × 1 ml 培养物中分离出的合并外泌体（即我们在每个时间点从 1 ml 培养物中分离出 7 × 75 μl 等分试样，然后将它们合并在一起）. 然后通过向细胞/外泌体制剂中加入氯仿：甲醇 (2:1) 溶液 (3 ml)，从这些样品中提取脂质进行分析。
苏州阿尔法生物提供的生物反应器、PCR仪、振荡培养箱、离心机、细胞计数仪、细胞分析仪、电泳仪、粒径分析仪、流式细胞仪等广泛用于细胞外囊泡的分离和表征研究等。
一、细胞培养
1.培养基与细胞
细胞可使用CHO系中的CHO-S 细胞。
培养基使用 CD-CHO 培养基（ThermoFisher）。在培养基中添加 8 mM L-谷氨酰胺利于CHO细胞生长。
2. 培养：
培养物通常在锥形瓶中以 20 ml 分批培养模式在二氧化碳振荡培养箱中 37 °C 下以 120 rpm 摇动培养。细胞每 3-5 天传代一次，接种率为 0.2 × 10 6 个活细胞/ml。对于制备外来体制剂的分批培养，将细胞以 0.2 × 10 6 个活细胞/ml 接种在 20 ml 培养物中，然后在培养的第 3 天和第 5 天收获上清液。
3. 收获：
收获后的样本，细胞沉淀物和 5 个 3 × 10 6细胞沉淀物样品进行等分，用于细胞脂质和蛋白质分析。通过高速离心机以 2,000×g 离心 5 分钟沉淀细胞，并储存在 - 80 °C超低温冰箱中。所有剩余的培养物上清液都用于分离外泌体，如下所述。
二、通过聚合物沉淀法 (PBP) 制备外泌体
根据制造商的指南，使用 TEI 总外泌体分离试剂盒（Invitrogen）从培养基中分离外泌体。将细胞培养基以 2000× g离心30 分钟以去除细胞和任何碎片；随后将上清液小心移至离心管管中，加入 0.5 倍体积的 TEI 试剂，充分混合并在 4°C 下孵育过夜。然后将样品在 4°C 下以 10,000× g离心1 小时，然后在弃去上清液后，将富含外泌体的颗粒重新悬浮在 75 μl PBS 缓冲液中。然后将样品储存在 - 20°C 下，直到需要进行后续分析。
外泌体的表征分析
1.动态光散射
使用 Anton-Paar Lightsizer 500 粒子分析仪测定外泌体制剂中的粒度分布。动态光散射测量由于溶液中粒子的布朗运动引起的散射光强度的动态波动，（685 nm 的激光，检测角度为 15、90、175 度）；较小的粒子比较大的粒子移动得更快。
确定颗粒大小时，通常使用三种分布类型：
(1) 数量分布，报告不同大小“箱”中的颗粒数量；
(2) 体积分布报告不同尺寸类别的颗粒总体积；
(3) 强度分布，报告不同大小颗粒散射的光。
也可以使用高分辨率纳米粒径分析仪 Nanocoulter Ⅰ来分析样品中每种大小的囊泡的实际数量、浓度及粒子动态、Zeta 电位等。
为了进行分析，将先前储存在 - 20°C 的 75 μl 等分试样的外泌体制剂用 925 μl PBS 稀释（得到 1 ml）并转移到一次性比色皿中用于 DLS 测量。每个样品在 DLS 和 Zeta 电位实验中测量五次，如下所述。
2. Zeta 电位
通过电泳光散射 (ELS) 测量的 Zeta 电位测量粒子在电泳场中的速度。Zeta 电位是胶体分散体稳定性的指标（绝对值）和囊泡表面电荷的量度（+ 或 - 符号）。
3.电子显微镜分析
对于电子显微镜分析，外泌体制剂在 PBS 缓冲液中按 1:10 稀释，随后在等体积的 4% (w/v) 多聚甲醛和 1% (v/v) 戊二醛中固定 5 分钟。然后将样品置于 formvar-carbon 涂层的 600 目铜网格上，并在室温下干燥 5 分钟。随后将样品在乙酸双氧铀溶液（2% 水溶液）中进行对比，并在电子显微镜（Jeol1230 TEM）下观察，加速电压为 80 kV，并连接到数码相机进行观察 .
三、Bradford 分析法测定样品中的蛋白质含量
为了量化培养第 3 天和第 5 天的 CHO 细胞沉淀物和外来体制剂中的蛋白质含量，对细胞裂解物以及外来体裂解物和 75 μl 等分试样（每份均来自 1 ml 培养物）进行 Bradford 测定非裂解外泌体 。通过向细胞或外泌体制剂中添加先前描述的裂解缓冲液来制备裂解物。
1.SDS-PAGE 和蛋白质印迹
对裂解和未裂解的外泌体制剂以及分批培养第 3 天和第 5 天的细胞裂解物进行蛋白质印迹。所有样品均在还原（含有 β-巯基乙醇）或非还原 Laemmli 样品缓冲液中制备，在 95 °C 下煮沸 5 分钟，随后如前所述通过 12% SDS-PAGE 分离。每个蛋白质样品上样约 5 g。以下一抗用于已知外泌体标记物的蛋白质印迹；抗 CD63（Santa Cruz，sc-5275）、抗 CD81（Santa Cruz，sc-166029 和 sc-23962）和抗 TSG101（Santa Cruz，sc-136111）。
3. RNA分离和分析
从收获的第 3 天和第 5 天的 3 个外泌体样本中提取总 RNA。根据制造商的说明，使用总外泌体 RNA (TER) 和蛋白质分离试剂盒（Invitrogen）提取 RNA。从源自 1 ml 培养物的每个外泌体样品中洗脱出 30-35 μl RNA。然后使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计估计回收的 RNA 总量。
4.脂质分析
从 (a) 总细胞沉淀中提取脂质（1 × 10 6个活细胞，在第 3 天收获时含有 298.9 g 蛋白质，在第 5 天收获时含有 477.2 g 蛋白质），储存在 - 80 °C，和（ b) 从 7 × 1 ml 培养物中分离出的合并外泌体（即我们在每个时间点从 1 ml 培养物中分离出 7 × 75 μl 等分试样，然后将它们合并在一起）. 然后通过向细胞/外泌体制剂中加入氯仿：甲醇 (2:1) 溶液 (3 ml)，从这些样品中提取脂质进行分析。
苏州阿尔法生物提供的生物反应器、PCR仪、振荡培养箱、离心机、细胞计数仪、细胞分析仪、电泳仪、粒径分析仪、流式细胞仪等广泛用于细胞外囊泡的分离和表征研究等。