近年来，随着对蛋白酶K研究的深入，该酶的应用范围不仅在医疗诊断及科研领域得到了十分广泛的应用，该酶还作为替代其它作用范围较窄的蛋白酶，主要应用于造纸、工业制革、饲料生产、食品加工等行业中。此外，该酶还可以替代传统的通过化学方法处理原材料的方法，减少污染。
  在各行各业中，蛋白酶K的主要用途有：
①在分离DNA和RNA的过程中，用于核酸酶的蛋白水解失活。
蛋白酶K能降解与核酸结合的蛋白质，促进蛋白与核酸的分离，因此该酶在提取高分子量的核酸时具有很大的优势。蛋白酶K还常被用于RNA提取过程中抑制和降解RNase，防止提取的RNA被降解。RNA的质量对于cDNA合成、Northem印迹及杂交分析及体外翻译等实验的成败至关重要。但是RNA极不稳定、易于被环境中广泛存在的RNase降解，而利用蛋白酶K可创造一个不含RNase的环境、以防止在提取RNA时被RNase污染，因此该酶的使用是成功提取RNA的关键。在核酸提取实验中蛋白酶K的工作浓度大约是0.05-0.2mg/mL，一般情况下，提取一个样本的核酸大约需要0.1mg的蛋白酶K ，而在实际使用过程中，为了增加核酸提取效率，通常会将蛋白酶K进行加量使用。核酸检测量剧增，造成对蛋白酶K需求激增，蛋白酶K原有的供需平衡被迅速打破，导致蛋白酶K一夜之间成为了紧缺的防疫物资。
②在生活和工业用水中灭活病毒。
病毒外层结构一般以衣壳蛋白为主，因此蛋白酶K可以对病毒表面的蛋白进行破坏，进而造成病毒因结构不完整不再具有攻击宿主细胞的能力。有研究结构表明，在蛋白酶K浓度为67.51ug/mL条件下对纯水和生活污水中病毒处理lh，其对病毒的灭活率分别达到了99.4％和49.4％，而处理3h时，其病毒灭活率分别为>99.9％和81.8％。用含蛋白酶K的消毒剂对病毒灭活的优点是消毒剂为蛋白质，无污染，不产生有害消毒产物，是一种高效且环保的消毒方法。
③在肉类嫩化中的应用
蛋白酶K能分解肉中肌纤维与结缔组织的蛋白质，甚至可以分解弹性蛋白及胶原蛋白，使肉类的各组织结构发生改变，如肉中部分肽键断裂，吸水膨胀，质地变嫩，增强肉的口感。
④在其它生物行业中的应用，主要包括：
1）用于去除内毒素结合的阳离子蛋白，如溶菌酶和核糖核酸酶A。
2）可用于分离肝、酵母和绿豆线粒体
3）用于测定酶在细胞膜上的定位
4）用于石蜡包埋组织切片的处理，暴露用于抗体标记的抗原结合位点。
5）用于可传播海绵状脑病(TSE)研究中朊病毒脑组织样本蛋白的消化。
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