细数流式细胞仪验证的基本流程

1．流式细胞仪介绍

流式细胞仪(Flowcytometry)是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时利用检测器进行多参数、快速的自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围的细胞亚群从中分选出来。 但流式细胞仪的细节分辨率为零，即它只能测量一种细胞的总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的具体数目。流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、检测系统、分析系统四部分组成。目前已广泛应用于细胞生物学、免疫学、临床医学、基础科学研究、细胞遗传学、生物化学等研究的各个领域。

2．流式细胞仪的原理

流式细胞仪的工作原理为：将经特异性荧光染料染色后的待测细胞放入样品管中，细胞在气体的压力下进入充满鞘液的流动室，然后鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，与水平方向的激光束垂直相交，染色的细胞受激光照射后发出荧光或产生散射光，这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收，转变为电信号后，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。

3．相关术语

设门：划定某一区域的细胞群体，对其单独加以分析或分选。

调补偿：若两种以上的荧光素的发射光谱之间存在重叠，则需要调补偿。

MFI值：即为平均荧光强度。

4．为什么流式细胞仪要做验证呢？

流式细胞仪是对细胞或生物颗粒物理、化学等相关参数的自动分析和分选的装置，对流式细胞仪进行验证就是保证分析检测结果准确、可靠，所以必须对所用到的组成系统各部分进行验证，以证明该系统符合检测的目的和要求，这就是仪器验证。本质上讲，仪器验证就是根据检测物质的要求，预先对仪器设置一定的参数范围及合适的检测器，并通过设计合理的试验来验证该仪器是否符合检测项目的要求。这些验证项目如分辨力、线性相关系数、重复性、示值误差等某一个产生误差，其他的都会有一定的偏移，致使结果改变。仪器验证就是保证整个试验是否能成功的先决条件，只有经过验证的仪器，确保该仪器各部分都在良好的情况下才能用于细胞相关参数的分析、分选，使检测结果得到保证，使误差降低到最小。

5．流式细胞仪的验证项目

（1）  安装确认

a.  文件确认

b.  附件确认

c.  安装环境确认

d. 安装情况确认

（2）  运行功能确认

a.  运行功能确认

b.  软件控制功能测试

（3） 性能确认

a.  分辨力测试

b.   线性相关系数测试

c.  检出限测试

d.  漂移测试

e.  重复性测试

f.  示值误差测试

6．流式细胞仪的操作步骤

(1)  检测鞘液桶和废液桶的状态是否满足本次使用，盖紧黑盖；

(2)  检测稳压电源，打开电源，对系统进行预热5-10分钟；

(3)  打开气体阈，调节压力，获得适宜的液流速度，应排除管路中气泡；开启光源冷却系统；

(4)  在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；

(5)  利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0和90散射的荧光强度*，并要求变异系数为最小；

(6)  选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；

(7)  样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；

(8)  因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；

(9)  最后将所需结果打印出来，操作完毕，关机。

7．注意事项

a.   光电倍增管要求稳定的工作条件，所有需放置在避光的环境下；另外还要注意磁屏蔽；

b.   光源不得在短时间内（一般要1h左右）关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；

c.   液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡堵塞；

d.   鞘流液使用前要经过过滤、消毒，必须符合使用要求；

e.   不同的检测对象选用对应的滤片系统、放大器的类型等；

f.   特别注意的是每次检测都需要空白对照组，做对照试验；

g.   调节电压时，如果检测的目标细胞体积较小，可以适当提高电压值。

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