定量菌株的菌悬液制作方法

青岛高科技工业园海博生物技术有限公司

一、介绍

    细菌个体微小，无法用肉眼直接观察计数，而平板上的菌落是数以亿计的细菌集合体。在《中国药典》及《GB4789.28 培养基和试剂的质量要求》标准中，进行培养基的质量检验时，需要用到10-100CFU/mL或其他浓度的定量菌株菌悬液，制作定量菌株菌悬液是微生物实验技术操作的基本技能之一，通常使用十倍或百倍稀释法进行制作。

二、稀释剂的选择和应用

（1）0.85%生理盐水或0.9%氯化钠溶液（在国标中通常使用0.85%生理盐水，中国药典中常使用0.9%氯化钠溶液，二者效果无明显差别），可适用于绝大多数细菌或真菌的菌悬液（或孢子悬液）制作。

（2）磷酸盐缓冲液，与生理盐水效果接近，可用于菌悬液制备和稀释，但更常用于样品的稀释。

（3）0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，相比较于生理盐水，此两种缓冲液对于产气荚膜梭菌、生孢梭菌等厌氧菌的效果更好，更能保持细菌的活性。该培养基因含有少量蛋白胨，细菌易发生繁殖导致菌数发生变化，通常制备的菌悬液需在短时间内使用（一般细菌建议在45min内使用，厌氧菌建议在15min内使用）。

三、操作方法

1.菌液稀释法

将待稀释菌接种至非选择性肉汤培养基中（如金黄色葡萄球菌、沙门细菌可用TSB培养，白色念珠菌、酵母菌可用沙氏葡萄糖液体培养）置于30-35℃或36±1℃过夜培养（真菌可培养48-72h），吸取1mL培养物至9mL生理盐水中，为10^-1稀释度，依次往下稀释，细菌通常在10^-6或10^-7稀释度可以得到10-100CFU/mL的菌悬液，酵母菌、芽孢菌通常要少做1-2个稀释度（即10^-5稀释度左右）。

2.菌苔稀释法

与菌液稀释法不同的是，此方法是挑取平板上的菌落进行稀释。将待稀释菌接种至非选择性平板上（一般细菌常用TSA，真菌常用SDA或PDA）培养至菌落生长合适大小，用接种环挑取直径2-3mm的单个菌落（若菌落较小，可多挑几个菌落）至9mL生理盐水中制成菌悬液，为10-1稀释度，用十倍或百倍稀释法往下稀释，通常在10-7稀释度左右可以得到10-100CFU/mL的菌悬液，酵母菌、芽孢菌通常要少做1-2个稀释度。

与菌液稀释法相比，此方法稀释得到的菌液浓度更容易控制，可以更好的精准控制在范围内，而且得到的菌悬液活性较为一致。菌液稀释法相对而言，偏差更大，制成的菌悬液有时会出现细菌活性有差别（在平板上表现为菌落大小不一），但该方法对新手而言，更容易操作。

3.霉菌的孢子悬液制作

将霉菌接种至沙氏琼脂（或马铃薯葡萄糖琼脂）斜面（或平板）进行培养至产丰富的孢子，加入稀释剂进行洗脱（也可用接种环直接挑取一环孢子至稀释液中），再用十倍或百倍稀释法制成适宜浓度菌悬液。

注：（1）培养过程中不可密封培养，保持良好的透气性有利于霉菌的生长和产孢子；（2）不同的培养基营养存在差别，霉菌生长后期，培养基内的营养逐渐耗尽后，霉菌倾向于开始产孢子，因此在培养过程中不同培养基产孢子时间存在差异；（3）孢子容易在空气中漂浮扩散，因此若采用接种环挑取孢子时，应做好防扩散污染的措施。

4.芽孢悬液制作

将芽孢菌接种至硫酸锰营养琼脂（或其他产芽孢培养基）36±1℃培养5-7天（或其他合适温度培养），刮取菌苔至稀释液中制成悬液，将菌悬液置于65℃中水浴30min（或沸水浴10min）杀死菌体，再用十倍稀释或百倍稀释法制成适宜浓度的芽孢悬液。

注：制备好的菌悬液原则上应现制现用（一般应在45min内使用，厌氧菌应在15min或更短时间内使用，时间过久菌数会有较大变化），孢子悬液、芽孢悬液相对比较稳定，可以在2-8℃保存较长时间，可在经过验证的期限内使用。