安捷伦二维液相色谱助力维生素 D 测定第四法
时间：2021-05-11 阅读：2846
安捷伦二维液相色谱精准助力应对 2020 版药典 0722 维生素 D 测定第四法
维生素 D 是人体所必须的脂溶性维生素。维生素D的基本作用是能促进钙和磷的吸收，缺乏维生素 D，会影响钙的吸收和骨代谢，最终引起佝偻病、软骨症或骨质疏松症等。作为药物的维生素 D 相关制剂是补充维生素 D 缺乏的最直接的途径。准确测定维生素 D 及其前体的含量，能够保证维生素 D 达到目标的效价，从而保证药物的有效性和安全性。
安捷伦二维液相色谱精准助力应对
2020 版药典 0722
维生素 D 测定第四法
2020 版药典 0722 新增维生素 D 测定第四法相关背景
维生素 D 测定的难点在于含维生素 A 醇及其他相应脂溶性杂质的供试品，如维生素 AD 软胶囊、滴剂等，其基质中存在大量油性辅料（大豆油）和维生素 A 醇的干扰，同时维生素 D2/D3 含量低（部分品种维生素 D2/D3 含量仅占 1‰ 左右) ，加上维生素 D 易受光热影响产生前维生素 D（pre-vitamin D）、反式维生素 D (Trans vitamin D)、速甾醇（tachysterol）和光甾醇（lumisterol）等。对于本类样品，2015 版药典和 2020 版药典的第二法和第三法，通常需要将样品进行皂化、有机溶剂液液萃取，结合反相色谱系统净化，最后再采用正相色谱系统进行定量检测。方法测定结果的准确性和重现性较难控制，也严重影响方法的分析效率。
通过二维柱切换的液相色谱技术不仅可以提升系统分离能力，改善结构相似化合物的分离分析；同时可以通过第一维的初步分离去除样品基质中大量杂质成分干扰，实现样品净化。因此 2020 版药典 0722 维生素 D 测定新增了第四法即在线二维液相色谱法，方法第一维和第二维均采用正相色谱体系，其主要优点是样品可用正己烷溶解后直接进样分析，且具有载样量大，易去除非极性基质干扰成分，同时维生素 D 与其他羟基化的代谢物分离良好等优点。
安捷伦的应对方案
仪器系统的基本搭配如图 1 所示，整体上需要两套泵、一个两位六通切换阀、单或双紫外检测器组成。
主要色谱条件
色谱柱：
第一维：ChromCore VD-ChP4, 2.1*150mm，3μm（纳谱分析，货号S015-030012-02115S）；
第二维：Zorbax Silica, 3.0*100mm, 1.8μm（Agilent Technologies，货号 828975-301）；
流动相：第一维：A: 正己烷；B: 异丙醇; C: 正己烷：正戊醇：异丙醇 (98：1：1); 按下表进行梯度洗脱：
表 1. 第一维流动相梯度
第二维：正己烷：正戊醇：异丙醇=996：2：2；等度洗脱。
流速：0.5 mL/min;
柱温：40℃；
波长：265 nm；
阀切时间窗口：前维生素 D， 保留时间前后各 1.5min；维生素 D，出峰开始前和结束后各 1.5 min；Loop 环体积为 9 mL。
对照品和样品溶液按照《中国药典》2020 年版四部通则 0722 维生素 D 测定法第四法要求进行制备。
主要结果
1、对照品分析谱图
按照药典采用脲基修饰的 HILIC 色谱柱和正相体系作为第一维分离，结果前维生素 D 和维生素 D 的分离度为 9.8，维生素 D 的理论板数为 7600，*系统适应性测试要求；目标物在第二维分离的峰对称性良好。
2、实际样品与对照品叠加谱图
由第一维的样品分离谱图可以看出，虽然维生素 D 分离良好，但前维生素 D 由于含量较低，易受到前面大量基质的干扰，通过柱切换方式将该目标组分切至第二维进行分离，能够对前维生素 D 实现无干扰分离分析。
小结
通过二维柱切换法，能够有效去除样品基质干扰，改善前维生素 D 的分离，实现对前维生素 D 和维生素 D 的定量分析；
本法对原有标准方法中 35~60min 的清洗过程进行适当调整，嵌入了强洗过程，既利于强保留化合物的快速洗脱（图 3 中 36-46min 色谱峰），缩减整体分析时间（由 80min 缩减到 65min），加快分析效率，也可避免潜在的强保留物质对后续分析造成影响，使第一维分离更稳定；
由于流动相配制和色谱柱批次间的差异，需要适当调整维生素 D 在第一维色谱柱上的出峰时间在 25min 左右，同时通过对流动相比例的微调，可以使样品中含量较低且易受基质干扰的前维生素 D 在第二维中分离更好。