一、引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。dna合成仪有很多种,主要都是由abi/pe公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
 

　　二、主要为abi3900高通量合成仪，合成长链主要采用beckman1000m和pe8909dna合成仪，引物修饰和高od数合成采用abi394等。亚磷酰胺三酯法合成dna片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将dna固定在固相载体上完成dna链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。第一步是将预先连接在固相载体cpg上的活性基团被保护的核苷酸与三氯YI酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团dmt。
 

　　三、PCR是为测序富集模板DNA的一种相对简单的方法。为保证DNA序列准确性，强烈建议使用高保真PCR来制备测序模板。在Sanger测序中，PCR扩增片段经纯化并用于测序反应。使用常用的测序引物结合位点(如M13或T7“通用引物”结合位点)对PCR引物的5′末端进行标记，以简化测序工作流程。