淋巴成纤维细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。
4、细胞计数与活力评估：在进行细胞传代、复苏或冻存前，进行细胞计数与活力评估是至关重要的步骤。①取少量细胞悬液，与等体积的0.4%台盼蓝溶液混合，静置2-3分钟。②使用血细胞计数板，在显微镜下计数活细胞（未被台盼蓝染色的细胞）与死细胞（被台盼蓝染成蓝色的细胞）。③计算细胞总数及活力百分比（活细胞数/总细胞数×100%）。确保细胞活力高于90%方可用于后续实验，以保证实验结果的准确性和可靠性。

5、培养环境优化：淋巴成纤维细胞的培养还需注意培养环境的细节优化。①维持培养箱内的温度恒定在37℃，湿度饱和，并通入5% CO₂以保持适宜的pH值。②定期更换培养基，一般为每2-3天一次，以去除代谢产物，补充营养物质。③使用经过灭菌处理的器材和试剂，减少污染风险。通过这些措施，可以进一步提升细胞的生长状态，促进实验的顺利进行。