【实验目的】

体外检测小鼠血清中TNF-α的浓度，了解小鼠攻毒后对TNF-α的变化的影响

【实验原理】

将酶与试剂抗原用交联剂结合起来，此种酶标记抗原与抗本中相应抗体发生特异反映，并牢固结合，在加入相应的酶的底物时，底物被酶催化生成呈色产物，可根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量观察。本实验采用双抗夹心Elisa法检测样本中小鼠TNF-α的浓度

【实验试剂和器材】

试剂：TNF-α定量分析酶联免疫检测试剂盒

器材：4℃和-20℃冰箱、水浴锅、恒温箱、酶标仪、电脑、排枪、移液枪、加样槽、涡旋振荡器、枪头、96孔板

【实验步骤】

用去离子水将洗涤液稀释到1倍（用到移液器）；将不同浓度标准品（100ul/孔）加入相应空中（96孔板、移液器），对于血清先加入50ul样本分析缓冲液后加50ul血清，若稀释量大，就将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育120min（漩涡振荡器、恒温箱）；`用1倍洗涤液洗板5次，且后一次至厚吸水纸上拍干；加入生物素化抗体工作液（100ul/孔）。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育60min；洗板5次，且后一次至厚吸水纸上拍干（多孔道手动移液器）；加入酶结合物工作液（100ul/孔）。用封板胶纸封住反应孔，避光室温孵育20min；洗板5次，且后一次置厚吸水纸上拍干；加入显色剂TMB100ul孔，避光室温孵育20min，加入终止液50ul/孔，混匀后即可测量OD450值（电脑、酶标仪）

【注意事项】

1、ELISA实验是一个很*确的实验过程，所以要*确稀释和加样

2、恒温箱中反应时，要严格按照上面的时间，不易过长

3、也可用洗板机洗板5次

4、反映终止后要快速测OD值，保证结果的准确性