本文要点：胶质母细胞瘤（GBM）是最致命的原发性脑肿瘤之一，但其诊断和治疗仍然是一个巨大的挑战。本文报道了中性粒细胞靶向的半导体聚合物纳米治疗平台（SSPNiNO）用于小鼠模型中原位胶质母细胞瘤的近红外二区（NIR-II）荧光成像引导的三模态治疗。SSPNiNO是由两种半导体聚合物分别作为NIR-II荧光探针和光热转换剂制成的。热响应一氧化氮（NO）供体和腺苷2A受体（A2AR）抑制剂共同整合到SSPNiNO中，以实现三重治疗作用。SSPNiNO表面附着有中性粒细胞靶向配体，通过“特洛伊木马”方式介导其有效递送到原位GBM位点，从而实现高灵敏度的NIR-II荧光成像。在NIR-II光照下，SSPNiNO通过NIR-II光热效应有效地产生热量，这不仅可以杀死肿瘤细胞并诱导免疫原性细胞死亡（ICD），还可以控制NO释放以增强肿瘤ICD。此外，封装的A2AR抑制剂可以通过阻断腺苷-A2AR通路来调节免疫抑制性肿瘤微环境，从而进一步增强抗肿瘤免疫作用，显著抑制原位GBM的进展。本研究可以为NIR-II荧光成像引导的有效GBM治疗提供一种具有累积治疗作用的多功能治疗纳米平台。

活体成像

图1. 成像引导下原位GBM光热NO免疫治疗的纳米诊疗方案

在这项研究中，构建了一种基于半导体聚合物（SP）的纳米治疗平台，将其用于NIR-II荧光成像引导的原位GBM光热NO免疫治疗。中性粒细胞靶向配体唾液酸（SA）共价连接到纳米治疗平台上（图1a）提高GBM的靶向能力。中性粒细胞可以穿过BBB并渗透到胶质瘤中，因此SA结合的纳米治疗平台也可以穿过BBB，并通过结合到中性粒细胞表面来提高纳米治疗试剂向GBM位点的递送效率。这些纳米诊疗平台包含两个SP，分别在NIR-II激光照射下实现对GBM的NIR-II荧光成像以及进行NIR-II PTT。产生的热杀死了肿瘤细胞，并触发了热反应性NO供体释放NO，以实现PTT控制的气体治疗，通过诱导ICD效应光敏GBM肿瘤。这种纳米治疗剂递送腺苷2A受体（A2AR）抑制剂来调节GBM的免疫抑制微环境，进一步增强抗肿瘤的免疫反应。因此，NIR-II荧光成像引导的光热NO免疫疗法对GBM治疗显示出良好的效果。

图2. 纳米平台NO和A2AR抑制剂释放性能评价

为了研究制备的纳米治疗试剂的光热性能，使用红外热像仪监测了在1064nm激光照射下的纳米颗粒溶液的温度波动。SSPNNO、SPNiNO和SSPNiNO溶液的温度在激光照射下迅速升高，并在照射6分钟后达到峰值（55°C）（图2a）。这些纳米粒子的加热和冷却曲线相似，表明它们具有一致的光热性能。纳米治疗的光热效应表现出对纳米粒子浓度和激光功率强度的依赖性。在激光照射6分钟后，SSPNiNO溶液的温度分别升高到41.9、55.0和66.9°C，激光功率强度分别为0.5、1.0和1.5 W cm-2（图2b）。当功率强度设置为1.0 W cm-2时，SSPNiNO溶液的温度分别在12.5、25、50和100µg mL-1的浓度下升高到32.2、43.0、55.0和65.5°C（图2c）。在NIR-II激光器开启/关闭的5个周期内，SSPNNO、SPNiNO和SSPNiNO的加热和自然冷却曲线几乎没有变化（图2d），表明它们具有良好的光热稳定性。这些纳米粒子的光热转换效率约为57.4%（图2e）。

光热触发S-NO键断裂后，热响应性NO供体可以释放NO。使用NO荧光探针确认激光照射后NO的产生。NIR-II激光照射导致NO荧光探针的荧光强度显著增加，这种增强的幅度与照射持续时间呈正相关（图2f）。通过Griess试验定量研究了光热触发的NO释放。在没有激光照射的情况下，NO的释放可以忽略不计，但这取决于激光功率的强度和激光照射下纳米粒子的浓度。0.5 W cm-2的激光不足以引发NO释放，而与1.0 W cm-2于的激光相比，1.5 W cm-2的激光可以引发更多的NO释放（图2g）。在相同的激光照射条件下，SSPNiNO的浓度对NO释放量有正比影响（图2h）。还对A2AR抑制剂的释放进行了评估，结果表明约60%的药物可以在24小时内释放（图2i）。

图3. 原位GBM脑靶向效果评价及NIR-II荧光成像

使用原位GBM模型评估了纳米治疗诊断药物的体内脑靶向能力。从原位GBM的小鼠中提取大脑。与对照组和SPNiNO处理的小鼠相比，SSPNNO和SSPNiNO处理的小鼠的脑荧光强度显著升高（图3a，b）。此外，在肿瘤部位观察到荧光信号。提取的大脑也被切成切片进行免疫荧光染色。尽管在SPNiNO治疗组的大脑中也可以检测到荧光信号，但在SSPNNO和SSPNiNO治疗组的脑中检测到信号（图3c）。与SPNiNO处理组相比，SSPNNO和SSPNiNO处理组的荧光强度增加了约三倍。此外，Ce6标记的SSPNNO和SSPNiNO的荧光信号与中性粒细胞的染色信号显示出高度的共定位，这意味着中性粒细胞劫持在促进靶向纳米治疗药物的肿瘤积聚中起着至关重要的作用。

使用纳米治疗仪验证了原位GBM的NIR-II荧光成像（图3d）。全身给药后，GBM位点的荧光逐渐升高，SSPNNO、SPNiNO和SSPNiNO注射的小鼠在24小时时也达到峰值（图5e）。此时，注射SSPNNO和SSPNiNO的小鼠的GBM位点信号比注射SPNiNO的小鼠强得多。定量分析显示，与注射SPNiNO的小鼠相比，注射SSPNNO和SSPNiNO的小鼠原位GBM位点的NIR-II荧光强度增加了约2.0倍（图3f）。这验证了使用SSPNNO和SSPNiNO对原位GBM进行靶向NIR-II荧光成像的可能性。

图4. 小鼠原位GBM的体内疗效评价

原位C6-GBM携带Balb/c小鼠模型已用于体内抗肿瘤作用评估。使用原位萤光素酶（Luc）-C6-GBM小鼠模型评估了纳米治疗剂的体内抗肿瘤疗效（图4a）。用NIR-II激光照射原位GBM位点以介导体内抗肿瘤治疗，并记录肿瘤的温度。在NIR-II照射10分钟后，注射SSPNNO和SSPNiNO的小鼠的肿瘤温度升高了≈27.0°C，比NIR-II激光照射下注射SPNiNO的小鼠高10°C。如图4b所示，与对照组相比，注射SSPNiNO和NIR-II激光照射（10分钟）显示出显著的肿瘤生长抑制作用，这可以从肿瘤部位Luc信号强度的显著降低中得到证明。相比之下，SPNiNO+激光和SSPNNO+激光仅显示出部分抑制作用。SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光组肿瘤部位的生物发光强度总体上低于PBS、游离A2AR抑制剂和SSPNiNO组（图4c），表明基于纳米治疗的组合疗法具有抗肿瘤疗效。SSPNiNO+激光组在治疗18天后，肿瘤部位的生物发光强度。还通过测量小鼠的存活时间来评估抗GBM的疗效。在对照组中，C6-GBM模型的中位生存期仅为23天，而游离A2AR抑制剂治疗将中位生存时间略微增加到24天（图6d）。相比之下，SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光组的存活时间延长。在用NIR-II激光照射SPNiNO和SSPNNO后，60%的携带GBM的小鼠在接种肿瘤38天后仍然存活。SSPNiNO+激光组在整个观察期内，所有携带GBM的小鼠均存活。携带GBM的小鼠的体重在肿瘤生长过程中逐渐下降。SSPNiNO+激光组的体重减轻最小，表明其抗GBM疗效。

组织学染色分析以进一步研究抗GBM疗效。在PBS、游离A2AR抑制剂和SSPNiNO组显示出完整的肿瘤细胞形态，没有坏死（图4e）。SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光组肿瘤明显消融，这些组中检测到肿瘤细胞坏死。SSPNiNO+激光组细胞坏死程度，脑内几乎未观察到肿瘤细胞。Ki-67染色显示癌症细胞的增殖能力， SSPNiNO+激光组的信号最弱（图4e）。结果表明，SSPNiNO在NIR-II激光照射下可以达到的抗GBM疗效。

图5. 体内ICD诱导和腺苷代谢评估

研究治疗后的ICD效果。在SPNiO+激光、SSPNO+激光和SSPNiNO+激光组中，绿色荧光信号相比对照组显著增加（图5a）。在SSPNO+激光和SSPNiNO+激光组中，与PBS组相比，HMGB1荧光强度分别增加了1.8倍和2.2倍（图5b）。SSPNO+激光和SSPNiNO+激光组的CRT染色信号强度分别增加了6.1倍和7.4倍（图5c）。因此，与PBS组相比，SSPNO+激光组肿瘤中的ATP水平分别增加了1.8倍和2.2倍（图5d）。然而，SSPNiNO和游离A2AR抑制剂组的ATP水平没有显著升高。

ATP可以在肿瘤微环境中被外核苷酸酶水解为免疫抑制腺苷，可以通过作用于各种免疫细胞上表达的A2AR，发挥免疫抑制作用。与PBS对照组相比，SSPNO+激光和SSPNiNO+激光组的肿瘤中腺苷水平分别增加了约1.4倍和1.6倍（图5e）。免疫荧光染色用于验证腺苷免疫抑制肿瘤微环境的调节。这揭示了这些纳米治疗剂释放A2AR抑制剂以阻断腺苷与A2AR的结合（图5f）。NIR-II PTT和NO气体治疗触发了肿瘤细胞的ICD，这可以将冷GBM转化为热表型，以改善效应T细胞向肿瘤组织的浸润。此外，A2AR抑制可以逆转腺苷对浸润T细胞的免疫抑制作用，从而协同增强免疫反应，提高抗肿瘤疗效。

图6. 体内抗肿瘤免疫反应的评估

为了验证体内增强的免疫反应，研究了脾脏、引流淋巴结和肿瘤中的免疫细胞。如图6a所示，在各种治疗方案后，引流淋巴结中树突状细胞(DCs)的百分比有所增加。在SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光组中，DCs百分比分别增加到17.8%、16.8%和22.1%（图6b）。在SSPNiNO+激光组中观察到CD4 T细胞（33.4%）（图6d）。同样，在应用纳米治疗和NIR-II激光照射后，CD8 T细胞水平显著上升（图6e，f）。值得注意的是，SSPNiNO+激光组的DC、CD4 T细胞和CD8 T细胞总体上高于SSPNNO+激光组，这表明A2AR抑制剂对全身免疫功能具有调节作用。

还对原位GBM肿瘤进行了免疫荧光CD4、CD8和Foxp3染色，以评估局部免疫反应。SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光组与PBS、游离A2AR抑制剂和SSPNiNO组相比，CD4和CD8的荧光信号明显更强（图6g），在SSPNO+激光、SPNiNO+激光和SSPNiNO+激光组中，Foxp3染色信号减弱。与对照组相比，SSPNO+激光、SSPNiNO+激光和SSPNiNO+激光的Treg细胞分别减少了56.0%、75.0%和93.0%（图S35，支持信息）。这些结果表明，在SSPNiNO+激光组的原位GBM肿瘤中，CD4和CD8T细胞，但Treg细胞，表明免疫效果。NIR-II PTT和NO气体治疗的组合诱导了增强的ICD效应，以激活免疫反应，与A2AR抑制剂协同作用，实现免疫反应增强。

在本研究中，构建了含有两种SP，一种热反应性NO供体和A2AR抑制剂的中性粒细胞靶向纳米治疗平台（SSPNiNO），用于NIR-II荧光成像引导的原位GBM联合治疗。SSPNiNO的表面被一种中性粒细胞靶向配体修饰，这使得它们能够粘附到中性粒细胞上，穿过BBB，并有效递送到原位GBM位点。两种SP的掺杂实现了NIR-II荧光成像和PTT。在NIR-II激光照射下，SSPNiNO可以将光能转化为热量，导致局部温度升高，热响应性NO供体释放NO。因此，在将SSPNiNO尾静脉注射到原位携带GBM的小鼠体内后，NIR-II激光可以远程触发原位NO释放和光热效应，从而诱导ICD效应和免疫“冷”肿瘤向“热”肿瘤的转变。此外，SSPNiNO递送A2AR抑制剂以阻断腺苷途径的抑制，进一步增强免疫效果以原位GBM。目前，这是使用聚合物纳米诊疗平台，在NIR-II荧光成像引导的原位GBM PTT-NO-免疫治疗中的开创性研究。

参考文献

Liu J, Cheng D, Zhu A, et al. Neutrophil‐Targeting Semiconducting Polymer Nanotheranostics for NIR‐II Fluorescence Imaging‐Guided Photothermal‐NO‐Immunotherapy of Orthotopic Glioblastoma[J]. Advanced Science, 2024: 2406750.