本文要点：本文研究了在荧光引导手术中含有西妥昔单抗-IRDye800CW的临床样本的SWIR 相较于 NIR 成像的潜在益处。通过记录吸收和发射光谱来检查表皮生长因子靶向 NIR 染料西妥昔单抗-IRDye800CW 在短波范围内的效果。使用含有西妥昔单抗-IRDye800CW 的鳞状细胞癌 （PSCC） 和头颈部鳞状细胞癌 （HNSCC） 患者临床肿瘤样本对 NIR 和 SWIR 图像进行离体比较。比较基于肿瘤背景比和适应性对比噪声比 （aCNR），使用护理病理学组织评估标准作为金标准。根据发射光谱，可以在 SWIR 范围内检测到西妥昔单抗-IRDye800CW。在临床 PSCC 样本中，发现总体SWIR成像性能与NIR成像相似（在检查的 2/7 标准中，NIR 成像优于 SWIR，在 3/7 标准中，SWIR 优于 NIR）。然而，在检查HNSCC 数据时，NIR 在几乎所有 （5/7） 检查标准中都优于 SWIR。这种差异似乎源于 HNSCC 组织中的背景自发荧光压倒了off-peak SWIR 荧光信号。在离体临床样本中使用靶向示踪剂西妥昔单抗-IRDye800CW 的 SWIR 成像目前没有提供比 NIR 成像额外的好处。SWIR 区域的背景荧光导致更高的背景信号，限制了 HNSCC 样品中的 SWIR 成像。然而，SWIR 显示出增加 PSCC 样本中肿瘤边界对比度的潜力。

本文报告了与 NIR 成像相比，肿瘤组织 SWIR 成像在外科肿瘤学中的潜在临床益处的研究。为此，使用临床样本的荧光图像将SWIR 成像与 NIR 光谱范围内的成像进行了比较。为了进行这种比较，评估了 ICG 和 IRDye800CW 在SWIR 光谱范围内的光学特性，并选择了目前可用的 NIR 成像系统。从而能够在鳞状细胞癌 （PSCC） 和头颈部鳞状细胞癌 （HNSCC） 的临床样本中使用表皮生长因子受体 （EGFR） 靶向 NIR 染料西妥昔单抗-IRDye800CW 在肿瘤可视化中对 SWIR 和 NIR 光谱成像进行系统比较。所有测量均在体外进行。目前，这是使用包含临床相关和剂量的这种靶向染料的临床样本来比较 SWIR 和 NIR 成像结果。改进荧光分子成像（FMI）方法可以改善肿瘤切缘评估，使患者预后受益。

图1. 近红外和 SWIR 图像配准。选择几个相关点使用平移矩阵（T）叠加图像。

近红外（NIR）和短波红外（SWIR）的对比是基于离体整体组织样本和组织切片的图像进行的。首先，离体整体组织样本的荧光图像进行了比较，因为这些图像更能代表两个系统在临床使用中的预期效果。图像的对比是以肿瘤组织的白光图像作为参考，比较了NIR和SWIR图像中高荧光强度和低荧光强度区域的位置。

随后，利用先前获取的组织切片作为基准，更精确地比较NIR和SWIR成像。这些组织切片的肿瘤和背景分割可以通过病理学家在H&E染色切片上的标记进行确认，并与相应组织切片的荧光图像相关联。为了进行有用的对比，需要分析NIR和SWIR荧光图像中相同区域的组织切片。因此，在MATLAB中使用“cpselect”和“fitgeotrans”函数进行了半自动图像配准，使用相似性变换类型获取变换矩阵（T）。

尽管对组织切除标本进行了实时荧光引导手术，但两种成像方式之间的有意义比较需要通过H&E 病理学评估。因此，对含有肿瘤的组织切片进行了比较，病理学家在其上指示了肿瘤边界。此外，使用具有光滑表面的组织切片可以采集两个系统可比较的荧光图像，从而促进更好的图像配准（图1）。最后，使用组织切片可能会减少 SWIR 成像在更深组织穿透方面的积极影响，从而减少散射。当样品厚度大于 NIR 成像的穿透深度时，SWIR 最能显示出其优势，因为在这种情况下，SWIR 成像的深度更深。在这项研究中，使用了4至5毫米厚的组织切片，估计 NIR 成像的组织穿透率∼2.2毫米。因此，在切片中，SWIR 在穿透深度方面仍有望显示出优于 NIR 的优势。

图2. 含有西妥昔单抗-IRDye800CW的小管的半峰全宽 （FWHM） 测量，该管嵌入脂肪乳 （a） 和牛组织 （b） 中，深度为 0、1、3 和 5 mm。强度分布基于使用各种滤光片获得的荧光图像中归一化强度的平均值。

对于SWIR成像系统，设置是基于不同深度下包埋在乳脂和牛组织中的IRDye800CW管荧光图像的全宽半高（FWHM）选择的。如图2所示，使用1300nm的长波通滤光片（LP 1300-nm）在乳脂和牛组织测量中都能得到的FWHM。然而，在检查归一化强度图时，噪声变得更加明显，这可能是由于荧光强度较低导致的。使用1200nm的长波通滤光片（LP 1200-nm）仅显示FWHM平均增加了7%，同时减少了抑制对比度的噪声。因此，使用1200nm的长波通滤光片被认为很好。根据图2的结果，SWIR成像在3mm的深度下应该是可靠的。

切除的标本包括共计十七片前列腺鳞状细胞癌（PSCC）和五片头颈鳞状细胞癌（HNSCC）肿瘤组织切片，这些切片根据病理学家的评估进行了分割。每个组织切片上绘制了四条线，分别得出PSCC的68条线和HNSCC的20条线。为比较NIR和SWIR成像在组织切片和线条上的表现，评估了多项标准。图4中给出了这些参数的概览。

为了比较NIR和SWIR成像性能，评估超出肿瘤边界的信号衰减似乎是一个有用的方面。因此，对穿过肿瘤进入背景组织的线条进行了NIR和SWIR信号的比较，见图4。首先，文本考虑在肿瘤中观察到的荧光强度是否能提供一个阈值，用于表征肿瘤中像素的荧光强度。背景中荧光强度超过该阈值的像素数量将表明该标准的稳健性，并可以在NIR和SWIR数据之间进行比较。这种比较导致了NIR和SWIR归一化荧光强度的像素散点图。对比度的计算是通过肿瘤组织中像素强度与背景像素强度之间的重叠进行的，结果显示SWIR在PSCC中重叠显著较少，而在HNSCC中重叠显著较多。像素强度图的简单线性回归显示，PSCC的中位数r²为0.550（0.233至0.740），HNSCC为0.260（0.0625至0.385）。Bland-Altman分析显示PSCC和HNSCC的偏差分别为0.0384（σ=0.175）和0.0957（σ=0.257）。

最后，考虑了三个不同的指标。首先，在一条线上绘制像素的归一化强度[图4 (b/f)]显示，PSCC中NIR和SWIR的图表相当，而HNSCC的对比显示出不同的强度分布。随后，使用病理分割计算并绘制了对应线条上的TBR和aCNR[分别见图4(c/g)和4(d/h)]。一条线上的平均TBR显示，PSCC中NIR和SWIR没有显著差异，但在HNSCC中发现了倾向于NIR的显著差异。比较线上aCNR时，SWIR在PSCC中显著优于NIR，而在HNSCC中，NIR显著优于SWIR。在比较aCNR曲线的AUC时也得到了相同的结果。在更详细地检查HNSCC样本时（图5），发现NIR信号与肿瘤组织对应，而SWIR信号不对应。在评估PSCC和HNSCC SWIR图像中的肿瘤和背景中的平均计数时，SWIR HNSCC图像中的背景自体荧光变得明显。对于肿瘤组织，这些是可比的，但HNSCC样本背景中的计数更高。即使在没有任何示踪剂的HNSCC患者组织中，也观察到了SWIR光谱范围内的背景自体荧光，而在NIR光谱范围内没有。

图5. HNSSC，PSCC 鳞状细胞癌的NIR和SWIR荧光图像与苏木精-伊红（H&E）染色的对比示例。

有趣的是，在基于aCNR比较NIR和SWIR图像时，研究者观察到在病理分析肿瘤边界处，aCNR曲线似乎在aCNR=1处交叉，而强度和TBR与肿瘤边界没有关系[分别见图8(d/h)与图8(b/f)和图8(c/g)]。因此，计算了基于病理分析的aCNR=1交叉点到肿瘤边界的距离。对于PSCC，找到交叉点的正一致性为91.8%，负一致性为36.8%。对于HNSCC，正一致性为75.0%。由于NIR在所有情况下都找到了交叉点，因此无法确定负一致性。在PSCC和HNSCC中，aCNR=1交叉点与实际肿瘤边界的交叉点之间的中位距离在NIR中显著更低。

然而，在外科肿瘤学中，肿瘤边缘对比度和肿瘤边界像素强度的差异可能更为重要。使用垂直于肿瘤边界的线[图4 (a/e)]，比较了两个系统的对比度和像素强度。在PSCC中，沿线的aCNR和肿瘤中的aCNR的AUC在SWIR成像中显著更高，而TBR没有差异。这再次表明背景中的较高荧光变化σ对NIR图像的影响。然而，NIR显示了到肿瘤边界的较小距离。尽管差异显著，但观察到的中位距离差异仅为0.2毫米，这可能是由手动分割误差和/或半自动图像配准与相应分辨率的结合造成的。这种偏差的临床相关性是可疑的，因为手术刀的厚度为0.1至0.5毫米。对于HNSCC，NIR成像在各个方面的性能都显著优于SWIR成像。这是由于SWIR荧光模式与病理结果之间的差异，而NIR显示的荧光模式与病理结果一致（图5）。

研究者注意到，根据H&E染色，aCNR曲线在垂直于肿瘤边界的线上的表现是比较肿瘤边界的高度相关参数。使用定义的aCNR，当aCNR=1的线与病理评估的肿瘤边界相交时，其偏差在PSCC的NIR和SWIR成像系统中均在成像系统分辨率的三倍以内（见图4）。HNSCC图像中的发现显示，NIR系统具有相似的结果，而SWIR成像系统的偏差较大。

在使用含有靶向染料的临床组织样本进行比较时，本文发现使用靶向示踪剂西妥昔单抗-IRDye800CW的非峰值SWIR荧光成像目前相比NIR成像没有提供额外的好处。这可能的一个重要原因是，在临床研究中使用的示踪剂剂量比临床前研究中使用的剂量低一百倍。未来的剂量研究应对此进行调查。需要考虑的另一个方面是，在某些组织类型中，背景荧光会淹没SWIR光谱范围内的NIR示踪剂的非峰值荧光，这限制了这种SWIR成像方法。当新的专用SWIR染料获得临床使用批准时，情况可能会有所改变。此外，本文开发了一种方法来系统地比较荧光图像，使用改良的对比噪声比（CNR），识别荧光边界，并且这种方法似乎适用于不同波长的荧光系统，与病理分析一致。

参考文献

Keizers B, Nijboer T S, van der Fels C A M, et al. Systematic comparison of fluorescence imaging in the near-infrared and shortwave-infrared spectral range using clinical tumor samples containing cetuximab-IRDye800CW[J]. Journal of Biomedical Optics, 2025, 30(S1): S13708-S13708.