大鼠T淋巴细胞亚群CD4+(CD4)ELISA检测试剂盒说明书

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被T淋巴细胞亚群CD4+(CD4)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的T淋巴细胞亚群CD4+(CD4)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法

1.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.  细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

• 酶标仪（450nm）
• 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
• 37℃恒温箱

操作注意事项

1.   试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶*溶解后再使用。
2.   实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.   预处理后的样本无需稀释，直接取10μL加样即可。
4.   严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.   所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：400、200、100、50、25、0ng/ml.

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1.   手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
2.   自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步骤

1.   从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.   设置标准品孔、样本孔和空白孔，空白孔什么都不加；标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.   待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；
4.   随后标准品孔和样本孔中（空白孔不加）加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体50μL，用        封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.   弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.   所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.   所有孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

 绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

试剂盒性能

•  准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9200。
•  灵敏度：可以检测浓度小于1.0 ng/ml。
•  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
•  重复性：板内、板间变异系数均小于15%。
•  贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
•  有效期：6个月
•  检测范围：6.25ng/ml -400ng/ml

免责声明

•   试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或猪体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
•   严格按照说明书操作，不同批号不可交换使用，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。