小鼠肝窦内皮细胞是非实质细胞中数目最多的细胞,约占肝非实质细胞总数的70%,在表型、功能上与普通内皮细胞有较大差异。肝窦内皮细胞之间缺乏细胞间连接,细胞下基底膜物质很少,因此窦内皮通透性较高,有利于调节物质交换。

　　不同于肝细胞的自我复制,肝再生时新生LSECs主要来自肝内外其他细胞成分的分化替代,不少研究证实了肝再生时LSECs的骨髓源性替代。内皮祖细胞是参与这一过程的主要细胞成分。

　　小鼠肝窦内皮细胞培养操作说明：

　　1)复苏细胞:将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻,加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟,弃去上清液,补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜(或将 细胞悬液加入 10cm 皿中,加入约 8ml 培养基,培养过夜)。第二天换液并 检查细胞密度。

　　2)细胞传代:如果细胞密度达 80%-90%,即可进行传代培养。

　　1. 弃去培养上清,用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。

　　2. 加 1ml 消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分 变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。

　　3. 按 6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟,弃去上清液,补加 1-2mL 培养液后吹匀。

　　4. 将细胞悬液按 1:2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。

　　3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类;

　　1. 细胞冻存时,弃去培养基后,PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶,细胞变圆 脱 落后,加入 1ml 含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。

　　2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞,根据细胞数量加 入血 清和 DMSO,轻轻混匀,DMSO 终浓度为 10%,细胞密度不低于1x106/ml,每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液,注意冻 存管做好标识。

　　3. 将冻存管置于程序降温盒中,放入-80 度冰箱,2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。