Amicon® Ultra超滤管 | 使用过程中的常见问题
时间：2024-07-25 阅读：206
之前我们有几期文章介绍了使用默克Amicon® Ultra超滤管的应用场景（分离外泌体、浓缩病毒），有很多老师反馈了一些超滤管使用时的问题，针对其中问的比较多的问题，小编特意进行了收集、整理。今天给大家介绍超滤管的使用过程中，离心力g与RPM的换算及常见问题的解答。
测量转子的半径
从离心机厂家文件上查阅转子半径，或像以下图示这样自己测量转子半径。
采用列线图计算RPM
绘制转子半径和建议的RCF（离心力g）图，连线确定RPM。
此列线图实际是通过右侧的公式计算得出的。
Q1：Amicon® Ultra超滤管的膜材质是什么？
A1：Amicon® Ultra超滤管的膜材质为默克密理博Ultracel®再生纤维素膜，生产工艺严格，截留分子量明确而精准，蛋白吸附损失最小。
Q2：如果要用超滤的方法分离两种蛋白，那么这两个蛋白的大小需要相差多少？
A2：按照经验，建议两个蛋白的分子量要相差一个数量级（10倍）。
Q3：Amicon® Ultra超滤管可以用于病毒浓缩么？
A3：可以。对于慢病毒推荐Amicon® Ultra 100 kDa； 对于腺病毒推荐Amicon® Ultra 50kDa。具体的操作步骤可以参考病毒浓缩纯化试剂盒FTLV00003和FTAV00003的产品使用说明书。另提供AAV（腺相关病毒）的制备方法供参考。
Q4： Amicon® Ultrar超滤管可以用酒精消毒灭菌么？
A4：Amicon® Ultra与70%乙醇是兼容的，但是对灭菌处理的具体方法没有做相关的测试，所以无法提供更进一步的参考信息。建议采用Ultrafree无菌离心管对浓缩后的样品进行过滤除菌。
Q5：Amicon® Ultra超滤装置是否可以用于高压灭菌？
A5：Amicon® Ultra都是采用热封设计，不可以用高压高温灭菌。
Q6：Amicon® Ultra超滤管是否不含RNA酶？
A6：不保证超滤管不含RNA酶，建议用0.1% DEPC在37度浸泡2h，以灭活RNA酶；残留的DEPC可以用Milli-Q®超纯水洗涤除去。
Q7：用Amicon® Ultra超滤管去除去污剂是有什么需要注意的吗？
A7：去污剂因其性质，当浓度大于临界微团浓度（Critical Micelle Concentration, CMC）时，去污剂分子会聚集形成微团而改变分子构象，这有可能会影响去污剂的去除效果。
Q8：蛋白在浓缩时出现了沉淀，如何改进？
A8：蛋白如果浓缩过快或者过度浓缩都有可能引起蛋白沉淀。建议蛋白浓缩后的最终浓度不超过20mg/ml。对于对浓缩速度敏感而容易沉淀的蛋白，建议的改进方法是：
离心力降为推荐离心力的30%-50%；
改用截留分子量更大的超滤管（如原本选用10k，此时可以选择30k）；
在浓缩过程中取出超滤管，用枪头反复吹吸几次后再继续浓缩；
体积较大的样品可考虑选用搅拌式超滤杯，减少沉淀的发生。
Q9：有时候用超滤离心管连水都离不下来，可能是什么原因？
A9： Amicon® Ultra超滤膜中含有微量甘油。 如果出现这种情况，请先用0.1N NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。
Q10：说明书中推荐在室温下进行离心，考虑到蛋白的稳定性，是否可以在4℃进行离心？
A10：可以，但是低温会增加蛋白样品的粘性，导致流速减慢，建议可将离心时间延长到原来的1.5倍。
Q11：浓缩后发现浓缩液中没有目的蛋白，可能的原因有哪些？
A11：首先，Amicon® Ultra超滤管的蛋白zui低起始浓度为25ug/ml。请确保样本的起始浓度大于这个浓度。其次，如果问题仍然出现，请不要丢弃样本滤过液以便用于分析可能的原因：
· 如果目的样本在滤过液中，那么请排查：
a）是否选择了合适截留分子量的超滤管（目的蛋白分子量的1/2或者1/3）？
b）使用的离心力是否是在限定范围内？如果使用的是rpm，请换算成相应的g离心力，具体换算方法请垂询。
c）离心机最近是否有校准过？
d）是否shou次尝试这个蛋白？如果能确保用同样的超滤管对其它蛋白成功操作的话，那么有可能是这个目的蛋白的原因。有时蛋白会因其本身的一些特性（构象差异）而影响浓缩效果，建议选用更小截留分子量的超滤管（如原本选用30k，此时可以选择10k）。
· 如果目的样本也不在滤过液中，那么：
a）蛋白样本起始浓度是否大于25ug/mL？
b）用来确定样本浓度的方法是什么？是否可信？
c）目的蛋白是不是沉淀了？如果是，具体解决方法请参考上面的关于蛋白沉淀问题的解释。
Q12：如何对超滤管进行去除内毒素的处理？
A12：提供的超滤管是没有经过去内毒素处理的，同时由于内毒素通常以多聚体的形式存在，大小在10-1000KD之间不等，在超滤的过程中是无法去除的。可在实验前通过先用0.5MNaOH预清洗，随后用Milli-Q®水/缓冲液清洗的步骤去除大部分内毒素。关于针对Amicon®、Microcon®、Centricon®尝试过的内毒素去除方案。
Q13：用浓缩后的蛋白做下游分析时发现有干扰，可能有哪些原因？
A13：Amicon®Ultra超滤膜含有微量甘油。如果此成分干扰分析，可用缓冲液或Milli-Q®水预清洗。如果干扰仍然存在，用0.1NNaOH清洗，然后用缓冲液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。
Q14：怀疑浓缩过程中目的蛋白和超滤膜之间可能存在非特异性吸附，如何改善？
A14：Amicon® Ultra超滤管使用的是再生纤维素膜，这种材质是蛋白吸附zui低的超滤膜。但是对于一些疏水性蛋白或非极性蛋白，它们和膜的非特异吸附可能会增强。对于这种情况，可以尝试在实验前对超滤管进行封闭处理，也可以尝试换成Amicon® Ultra 0.5或2来进行实验，通过减小膜面积来降低非特异性吸附。