细胞外囊泡 (EV) 在过去十年中取得了快速发展，在其起源、疾病相关性以及诊断和治疗等方面已有诸多的发现与报道。在这些研究领域中，对 EV 的全面表征至关重要，需要涵盖EV单颗粒及整体分析，例如粒度，电位，浓度，粒径分布，以及检测与 EV 相关的特征蛋白，例如 CD9、CD63、CD81、Alix 和 TSG1012-5。如果想对EV的表型进行更深入的分析，则须利用Western blotting、ELISA 或单囊泡/整体免疫标记等方法进行EV表型分析。
目前，还没有一种方法可以将单个囊泡上的蛋白质检测与整体粒度分布和浓度测量相结合。纳米颗粒追踪分析 (NTA) 是一种应用于表征 EV 粒度分布的技术。NTA 基于斯托克斯-爱因斯坦方程，通过追踪单个颗粒的布朗运动来确定单个 EV 和 EV 群体的尺寸。NTA 利用激光照射颗粒，理论上可以实现荧光染料的特异性激发和检测荧光标记的 EV (NTA-FL)。然而，目前只有少数研究对 NTA-FL 进行了严格的评估，并且这些研究依赖于非典型 EV 蛋白靶标或非特异性标记的免疫标记。
美国塔夫斯大学 (Tufts University) 的研究人员们报道了一种荧光免疫标记单个 EV 用于 NTA-FL 的优化算法，使得基于NTA的单囊泡免疫标记和检测与粒度分布和浓度分析更为精准。该算法可以有效地提高NTA检测结果可信度，为更深入研究 EV 的功能和机制提供了强有力的工具。
在前期研究中，研究人员们发现传统的利用NTA进行EV亚型分析的荧光/散射光比对方法会出现数据偏离的情况。通常情况，荧光 (FM) 曲线所围绕的面积与散射光 (LSM) 曲线所围绕成的面积的比值可以表示EV的纯度。但是这些研究人员们在分析过程中发现，在测试1，2，4中（表1，图1），FM（蓝线)与LSM（红线）的比值大于100%，表明EV纯度大于100%，这显然是不合理的，这种测试结果表明：1. 荧光检测过程中，可能出现了大量的假信号。
2. NTA 系统的技术限制导致 LSM 无法检测到非常小的 EV 或折射率低的其他颗粒。散射光模式下EV检测不全，有部分EV数据没有检测到，使得LSM面积偏小，从而导致比值大于100%。
3. 研究人员还发现，FM模式在50 nm以下的区域还有明显的信号峰出现，而对比LSM模式，其在50 nm以下信号基本衰减为0，这可能也是造成比值大于100%的原因之一。具体而言，这可能是游离的荧光分子没有充分去除，以及体系中游离的蛋白质被荧光分子标记，造成小尺寸分区中的荧光信号增强。
表1 不同样本的荧光面积（FM）与散射光面积（LSM）比值图1 不同样本在FM模式及LSM模式下NTA测试结果
为了解决这种情况，研究人员们提出了两种评估方法：
第一种方法是传统的计算方法，即计算样本中大于 50 nm的颗粒数量，并比较 FM 和 LSM 中的颗粒数量，得出 FM 与 LSM 之间的比例。（图2b，c）
第二种方法是优化后的计算方法，计算两种方法得到的粒度分布曲线之间的重叠区域，并将该区域与 LSM 中大于 50 纳米的颗粒总数量进行比较，得出重叠区域比例。（图2d）
在研究过程中，研究人员着重强调了他们对颗粒粒径选取的取舍。为了更精确地分析 EV，研究人员将分析范围缩小到 50-200 纳米。之所以选择这个范围，是因为大多数 EV 的尺寸都在这个范围内。此外，LSM对小于 50 纳米的颗粒检测能力有限，而大于 200 纳米的颗粒则可能并非 EV。因此，将分析范围缩小到 50-200 纳米可以有效地排除其他类型的颗粒，提高分析结果的准确性。
图2 基于NTA的免疫标记算法示意图
基于这种优化算法，研究人员对上述6组样本的数据进行分析，数据结果表明EV纯度都回落至小于100%。
表2 算法优化后不同样本的荧光面积 (FM) 与散射光面积 (LSM) 比值（SA）
上述算法利用量子点标记和 NTA-FL 技术，通过比较荧光模式 (FM) 和散射光模式 (LSM) 的结果，可以有效识别和分析在单个囊泡层面的不同亚型的 EV，并提供更精确的粒度分布信息。然而，尽管NTA-FL技术和优化算法可以有效提高EV亚型分析的准确性，但也必须认识到NTA技术在底层原理上存在一些局限性。NTA在检测非常小的EV或粒径分布宽的样本（尤其是EV样本）时存在一定的困难。因此，虽然NTA-FL技术和优化算法可以提高粒度分布和浓度分析的准确性，但NTA的技术瓶颈并未得到克服，后续的算法优化以及荧光标记方法能否在错误的基础上得到正确的结果仍需谨慎对待，以免过分依赖这一技术所得到的数据。NanoCoulter纳米粒度仪采用库尔特原理，打破了光学原理的局限性，可以精准分析每个过孔颗粒，实现真正意义上的单颗粒检测，对粒径分布广的多分散系样本有更好的测量效果。且不受样本的折射率、吸光度等光学性质影响，数据不拟合，最真实的反应样本状态。
