N-乙酰基-β-葡萄糖苷酶(NAG)活性检测试剂盒产品说明书
时间:2024-05-20 阅读:58
N-乙酰基-β-葡萄糖苷酶(NAG)活性检测试剂盒
(可见分光光度法)
产品货号:BA1934
产品规格:50T/24S
产品简介:
N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.52,N-acetyl-β-D-glucosidase,NAG)广泛分布于各种组织中,是一种细胞内溶体酶,测定NAG活性可用于肾小管间质性肾炎、尿路感染、糖尿病肾病综合症、高血压肾病、肾移植后的排异反应和肾病综合症的早期诊断。
NAG分解N-β-乙酰氨基葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定400nm下吸光度的 变化来计算NAG活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体30mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂二 | 粉剂×2瓶 | -20℃ |
试剂三 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃ |
标准品 | 液体1mL×1支 | 2-8℃ |
溶液的配制:
1. 试剂二:临用前取一瓶加入2.5mL蒸馏水溶解备用;可-20℃分装保存4周,避免反复冻融;
2. 标准品:5μmol/mL的对硝基苯酚溶液。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、天平、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声破碎仪、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、 研钵/匀浆器、EP管、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取0.1g组织,加入1mL提取液),冰浴匀浆。15000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2. 细菌、细胞:先收集细胞或细菌样本到离心管内,离心弃上清后,按照细胞数量104个:提取液体积(mL) 500~1000:1的比例,建议500万细胞加入1mL提取液),超声波破碎细胞(冰浴,功率200w,超声3s,间隔7s,总时间3min),然后15000g,4℃,离心10min,取上清,置冰上待测。
3. 血清(浆)等液体:直接测定。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2. 标准溶液的稀释:取125μL5μmol/mL对硝基苯酚溶液,加入875μL蒸馏水,充分混匀,配制成0.625μmol/mL 标准液使用,现用现配。(实验中每管需要50μL,为减小实验误差,故配制大体积。)
3. 操作表 (在1.5mL离心管中依次加入下列试剂) :
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
试剂一 | 300 | 300 | 300 | 300 |
试剂二 | 150 | - | - | - |
蒸馏水 | - | 150 | 150 | 200 |
标准液 | - | - | 50 | - |
样本 | 50 | 50 | - | - |
置于37℃水浴锅或恒温培养箱反应30min | - | - | ||
试剂三 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混匀后室温放置2min,测定400nm的吸光度,分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管,ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。标准管和空白管只需测1-2次。
三、NAG活性计算
1. 按蛋白浓度计算
活力单位定义:每mg蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
NAG (U/mg prot) =ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷(Cpr×V样)÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr
2. 按样本质量计算
活力单位定义:每g样本在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
NAG (U/g 质量)=ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷(V样÷V样总×W)÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷W
3. 按细胞数量计算
活力单位定义:每104个细胞在反应体系中每分钟生成1nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
NAG (U/104cell)= ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=20.83×ΔA测定÷ΔA标准÷细胞数量
4. 按液体体积计算
活力单位定义:每毫升液体在反应体系中每分钟催化生成1nmol对硝基苯酚为一个酶活力单位。
NAG (U/mL)= ΔA测定÷(ΔA标准÷C标)×1000×V样÷V样÷T=20.83×ΔA测定÷ΔA标准
C标:标准溶液浓度:0.625μmol/mL;V样:加入的样本体积,0.05mL;V样总:提取液体积,1mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,30min;细胞数量:以万计;W:样本质量,g;1000:换算系数, 1μmol=1000nmol。
注意事项:
吸光度若大于1.2时,建议将样本用提取液稀释后进行测定。