体外三维细胞建模和成像是候选分子毒性评估的一个有价值的早期步骤，3D细胞培养很大程度上可检测临床前药物开发工作流程，包括在细胞、组织、器官和整个有机体的迭代更高生物水平上的毒性评估。在这些层次上建模和成像的能力是分子评估和发展的强大工具。

3D细胞培养中的单个细胞提供了关于分子亚细胞对一般细胞功能的影响的数据，如细胞生长速度。3D细胞培养也用于评估特定细胞类型的毒性，提供组织和器官功能的数据。

3D细胞培养允许细胞生长，培养物向各个方向扩展，从而模拟自然的微结构。这种类型的培养提供了对分子对细胞间相互作用的影响，其方式比二维单层培养更具生理学意义。3D培养的高分辨率成像提供了分子对组织结构和完整性的影响的有价值的信息。

在药物开发过程的早期，拥有相关的、可靠的和可预测的细胞毒性数据，可以避免可能导致临床试验失败的毒性试验，从而有助于降低用药风险和科研成本。

一． 实验试剂准备：

1.准备好细胞培养试剂

2.将分装好的Matrigel基质胶提前24 h从-20℃放入4℃，使其融化成液体状态；将无菌的1 mL移液器枪头放入无菌50 mL离心管内，置-20℃冰箱预冷。

琼脂糖包被96孔板

3.准确量取6 mL 基础培养基于2个10 mL的注射玻璃瓶内，加入90 mg琼脂糖，盖塞后放入80℃的水浴锅内加热溶解30 min；

4.加热结束后，将注射瓶放入灭菌锅内，115℃灭菌30 min；

灭菌完成后，迅速取出注射瓶放入超净台内。将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入无菌的加样槽中，用多通道移液器以每孔60 μL的量加入96孔板内。

注意：由于琼脂糖溶液在室温时会凝固，因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后一定要快速转移至超净台内并迅速加入至96孔板中。

此外，为保证加样时琼脂糖不冷却，需要同时灭菌加样槽和100 μL的移液器枪头。

5. 加入完成后，96孔板要保持水平约30 min使孔内的琼脂糖凝固。

配置含Matrigel基质胶细胞悬液

二.3D细胞培养

取对数生长期的细胞以cell systems原代视网膜内皮为例，胰蛋白酶消化后进行细胞计数，用CultureBoost经典细胞培养基将细胞悬液浓度调整至2.0×105 cells/mL，备用。

将盛满碎冰的烧杯喷完酒精后放入超净台内，将CultureBoost经典细胞培养基以及解冻的Matrigel基质胶从冰箱内取出置于冰上.

注意：由于Matrigel基质胶在室温下溶液凝固，因此在操作过程中一定要保持低温。

3. 将预冷的移液器枪头取出放置于超净台内。根据计算量（2.5%，v/v）用移液器将300 μL Matrigel基质胶加入到12 mL *培养基内，迅速混匀。

注意：由于Matrigel基质胶在室温下溶液凝固，因此使用的移液器枪头也需要预冷。

加入步骤1中的细胞悬液（约600 μL），使细胞浓度为10000 cells/mL，迅速混匀，备用；

将细胞悬液铺入琼脂糖包被的96孔板

1. 将上述步骤4中配置好的含有Matrigel基质胶的细胞悬液放入加样槽内，用多通道移液器吸取200 μL加入到包被琼脂糖的96孔板内。

2. 采用低温离心机进行离心，离心条件为4℃，1000×g，10 min,将96孔板周围用封口膜封住。

3.人视网膜内皮细胞长的比较慢在培养的第3.7和10天，并2天更换一次孔内的100ul培养基。

若要做给药实验，计算好OD值和IC50，配成100ul的培养基，培养成球后，吸出常规培养基换成加药培养基即可。

Cell systems 3D培养参考文献：

Brown JA, Pensabene V, Markov DA, Allwardt V, Neely MD, Shi M, Britt CM, Hoilett OS, Yang Q, Brewer BM, Samson PC, McCawley LJ, May JM, Webb DJ, Li D, Bowman AB, Reiserer RS, Wikswo JP. Biomicrofluidics. 2015 Sep; 9(5): 054124. doi: 10.1063/1.4934713

Herland A, van der Meer AD, FitzGerald EA, Park T-E, Sleeboom JJF, Ingber DE. PLoS ONE. 2016; 11(3): e0150360. doi: 10.1371/journal.pone.0150360