作用原理

高保真DNA聚合酶含有聚合中心和酶切中心[1]，聚合中心具有5’-3’聚合酶活性，负责聚合作用；酶切中心具有3’-5’外切酶活性（也称校对活性），负责将不配对的核苷酸予以切除。

在PCR扩增过程中，当引物与模板*互补后，进入聚合中心，在聚合酶活性作用下，游离的脱氧核苷酸通过互补配对原则，依次结合到引物的3’端，新链DNA从5’到3’进行延伸（图1-a）；当引物末端结合的核苷酸与模板不配对时（图1-b），错配的核苷酸会翘起，新链DNA无法继续向前延伸，进而进入酶切中心，在外切酶活性作用下，错配的核苷酸会被切除（图1-c）；切除后此位点会重新结合正确的核苷酸，新链DNA又能继续从5’到3’进行延伸（图1-d），最终使新链DNA能够进行精准复制[1-2]。

图1. 高保真DNA聚合酶工作原理示意图[1-2]

应用方向

基因功能研究

案例：研究表明A基因可能参与拟南芥中花青素的代谢，为了验证这一假设，要先将A基因从拟南芥中扩增出来，构建到过表达或抑制表达载体上，通过农杆菌介导法转入拟南芥中，使A基因在拟南芥体内过表达或抑制表达，最后通过形态指标、生理指标及基因表达水平等来判定这一假设是否成立。

基因测序

案例：若想探究拟南芥中B蛋白家族中不同基因的异同点，需要先将B蛋白家族中的所有基因从拟南芥中扩增出来，得到这些基因的碱基序列，然后通过生物信息学分析来初步分析它们的异同点。

以上研究均需借助PCR技术将目的基因从物种中精准扩增出来，如果扩增出的基因序列出现突变，那么后续分析都会不准确；为了保证目的基因的精准扩增，我们在PCR扩增过程中就需要使用高保真DNA聚合酶。

答：反应体系：10 µl

①单酶：1 µl 10×Taq Buffer（MgCl2 Plus），0.5 µl dNTP Mix (10 mM)，0.2 µl Taq DNA Polymerase，1-7 µl纯化后PCR片段，ddH2O补齐至10 µl

问Q2：高保真酶DNA聚合酶扩增的片段一定不会突变吗？

答：高保真DNA聚合酶具有3’-5’的外切酶活性，在PCR扩增过程中可降低核苷酸错配的概率，保真度越高的DNA聚合酶，核苷酸错配的概率就会越低，但不表示扩增过程中绝对不会发生核苷酸的错配。因此，为了提高实验的成功率，建议同一样本挑取多个（>3个）单克隆进行测序。

问Q3：不同公司高保真DNA聚合酶的保真度有可比性吗？

答：高保真酶的保真度通常表示为是Taq酶的几倍，常见的保真度测定方法有：蓝白斑筛选测定、一代测序和NGS测序等。不同品牌DNA聚合酶的保真度测定方法不同，若想要比较不同品牌DNA聚合酶的保真度，必须采用相同的保真度测定方法，进行平行比对。

快速高保真酶推荐

参考文献:

[1] 黎景光. DNA聚合酶高保真原理应用于SNP检测的研究[D]. 暨南大学, 2006.

[2] Steitz TA. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J Biol Chem, 1999, 274(25): 17395–17398.