简介

在动物细胞培养过程中，必须有可以贴附的支持物表面，其依靠自身分泌或培养基中的贴附因子才能在该表面生长增殖的离体动物的培养细胞。

由于血清具有终止胰蛋白酶消化，提供细胞生长所需的贴壁因子、免疫球蛋白、胰岛素等其它营养成分及细胞因子，因此成为体外细胞培养液中的常用添加成分，其对细胞的培养意义重大。

原理

细胞在人工基质上单层生长（贴壁培养）
贴壁细胞分类：皮细胞型，成纤维细胞型，游走细胞型和多型细胞型。

在显微镜下观察时，贴壁细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形或扇形或其它形态，而且晃动培养液时，细胞不动。

培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态，呈成纤维细胞样或上皮细胞样等。

材料与仪器

【材料与试剂】细胞、PBS 或 DPBS、0.25% (w/v) Trypsin-EDTA、75% 乙醇、培养基（以DMEM为例）、100X 双抗（链霉素-青霉素）、胎牛血清、细胞冻存液。

【实验仪器与耗材】培养皿或培养瓶、移液枪、离心管、记号笔、封口膜、冻存管、程序降温冻存盒、液氮罐、离心机、37℃ 恒温培养箱（5% 二氧化碳浓度）、倒置相差显微镜、冰箱、无菌细胞操作台。

步骤

一、试剂准备
DMEM*培养基（10% 胎牛血清）：44.5 mL DMEM +5 mL 胎牛血清+500 μL 100X 双抗，摇匀，4 ℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒温水浴锅中预热 15 分钟。

PBS、*培养基、根据细胞特性选择合适的解离液（例如Gibco? TrypLE? Express、胰蛋白酶）或机械吹打消化细胞、胰蛋白酶解离剂 0.25%  (w/v) Trypsin-EDTA 4℃ 冷藏保存，使用前于37 ℃ 恒温水浴中锅预热 15 分钟。

二、 细胞复苏
1. 超净工作台使用前紫外线照射 30 分钟。使用前，后用 75% 酒精擦拭台面。保持台面干净整洁。使用时一定打开通风。

2. 将冻存细胞从-80 度冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2分钟内）37 ℃ 恒温水浴中预热水浴锅中（或在手心中反复摩擦），不停晃动以化冻。

3. 立刻将化冻的细胞液转移进装有 3 mL DMEM*培养基的 5 mL离心管中并吸打均匀。注意液体不要留在瓶口或瓶盖上，避免增加污染的可能。

4. 复苏细胞时，离心机提前降温至4℃，以 1000 rpm 的转速将细胞悬液离心 5 分钟并弃上清（离心的速度和时间根据细胞系的不同有所差异）。

5. 用 3 mL DMEM*培养基重悬细胞，并转移进 6 cm细胞培养皿中，放入细胞培养箱中。

6. 在显微镜下观察复苏细胞的状态（是否为单个细胞悬液，有无成团，活细胞的比例），并及时（每48小时）更换DMEM*培养基。

7. 当细胞密度占显微镜视野 80%-90% 时，应进行细胞传代。

三、贴壁细胞传代（以 6 cm细胞培养皿为例）
1. 弃置原培养皿中的培养基，从培养皿边缘加入 2 mL 预热的PBS平衡盐溶液润洗细胞（注意不要直接冲到细胞表面），并弃置。

2. 沿培养基侧壁加入1 mL预热的 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶*覆盖细胞表面。于细胞培养箱中孵育 2 min（孵育时间根据细胞系不同有所差异，如不确定细胞消化时间，每隔 1min 取出在显微镜下观察，约有 50-70% 细胞飘起，即可继续操作）。

3. 向培养皿中加入1 mL *培养基中和Trypsin的作用，并轻轻吸打细胞表层数次。将细胞悬液转移到 5 mL 离心管中，在室温下以 1000 rpm 的转速将细胞悬液离心 3 分钟。

4. 小心弃去离心管中的上清液，使用 1mL *培养基轻轻重悬细胞沉淀，使其*被吹打为单个细胞状态，尽量减少泡沫的产生。

5. 进行细胞计数后以 1:3（1:3～1:6均可）的比例进行细胞传代。

6. 取三只新 6 cm 细胞培养皿，每只培养皿中加入 3 mL *培养基，将细胞悬液平均分配至三只培养皿中，盖上盖子后，按照画“十字”的操作，将细胞摇匀。

7. 细胞培养皿放入细胞培养箱中，继续培养，每天观察细胞状态并及时更换培养液。

四、贴壁细胞冻存：
1、细胞处于生长对数期且状态良好时，收集细胞以便冻存；

2、制备冷冻培养液（含DMSO），在 4°C 下保存。注：合适的冷冻培养基取决于细胞系种类。

3、按照贴壁细胞传代培养过程中用的操作，将细胞解离下来；

4、600 g, 4℃ 离心 5 min 收集细胞，然后弃掉上清，从冰箱取出细胞冻存液重悬细胞，分装至冻存管中；

5、将冻存管移入程序降温盒中，再将程序降温盒放入 -80℃ 冰箱，过夜，第二天移至液氮罐中。

注意事项

1、严格进行无菌操作，每次拿取东西时应使用75%乙醇喷洒表面进行充分消毒；

2、细胞培养皿上应清楚标记：操作人、时间、细胞系；

3、化冻细胞速度应快，尽量在 5 min 内完成操作；

4、离心管放入离心机前应用封口膜缠绕；

5、超净台使用前应用紫外照射 30 min 以上；

6、所有与细胞直接接触的材料和仪器均应处于无菌状态

7、如果使用培养瓶，在将其放回培养箱之前，若使用的培养瓶的瓶盖不带透气孔，则需旋松瓶盖，以便进行适当的气体交换；

8、如果细胞培养基已冷藏（2-8°C），使用前在 37℃ 水浴锅预热；

9、细胞培养基保持避光储存；

10、细胞培养基添加 FBS 后，将*培养基放入冰箱（2-8°C）以保持性能。并在 2-4 周内使用含添加剂的培养基，以减少污染机率和 pH 值变化的影响；

常见问题

1. 所有与细胞直接接触的材料和仪器均应处于无菌状态。

2. 如遇Trypsin 消化不佳的细胞（如RAW264.7细胞），可以采取使用无菌的细胞刮刀轻柔的将细胞刮下再处理。

3. DMSO 具有细胞毒性，复苏细胞的过程操作要迅速，并用 3 倍体积以上的*培养基进行稀释。

4. 细胞复苏后应在 12～24 h 后观察细胞状态。如遇到细胞污染，应立即丢弃细胞，并对环境进行消毒。

5. 冻存细胞应选择传代次数较少的细胞，当细胞传代高于15 代后，细胞应丢弃，复苏新的细胞再进行试验。

6. 复苏后的细胞不能立即进行试验，需传代 2-3 代，待细胞生长状态稳定后，才可进行相关试验。复苏后细胞状态不佳，可考虑重新复苏；

若重新复苏后细胞状态仍旧不佳，可考虑适当提高胎牛血清的比例（从10%提升至15%，最大提升至20%），待细胞状态恢复后再使用平时使用的培养基。

7. 如想收获到更多数量的细胞，可以将 6 cm皿细胞悬液接种于10 cm皿中，并增大*培养基的使用量。

8、复苏细胞后细胞状态差：1）首先，冻存细胞时选择处于对数生长期状态良好的细胞；2）复苏时，水浴锅提前预热至37℃，离心机提前降温至 4℃；

9、细胞交叉污染：1）培养细胞系时尽量不要多种细胞系同时培养；2）不同细胞系培养基单独配置，尽量不要交叉使用；3）注意操作规范；