细胞周期检测（流式细胞术）
时间：2022-10-18 阅读：2252
原理
流式细胞周期检测是一种常见的检测细胞增殖情况的方法之一，细胞在不同周期时，其内的DNA含量不同。碘化丙啶（PI）作为一种核酸嵌入型染料，能够进入固定后的细胞中，与细胞内的核酸结合，其荧光强度与DNA含量成正比。通过流式细胞仪检测不同细胞中的荧光强度，从而判定不同组别中细胞周期发生的变化。
用途
检测不同组别或处理对某种细胞周期的改变。
材料与仪器
【器材】
流式细胞仪、移液器、枪头、离心管、离心机、流式细胞仪、水浴锅、流式管、滤头；
【试剂】0.25％ 胰蛋白酶溶液、PBS、RNA酶、PI染液、70％ 乙醇溶液（建议提前放入负二十预冷）；
步骤
1.以肿瘤细胞为例，将正常生长的对照或处理组肿瘤细胞计数，每组取2×105-3×105个细胞铺板，待细胞贴壁后，将正常培养基替换为无血清1640培养基，同步化20 h，使得所有细胞都进入相同的细胞周期时期；同步完后，将培养基重新替换为正常含血清培养基，继续培养24 h；
2.用不含EDTA的胰酶将细胞消化，收集细胞，300 g，离心3 min；用吸引器去除培养基，用PBS清洗细胞一次，再次300 g，离心3 min；去除PBS，用提前预冷的70%酒精重悬细胞沉淀，4℃固定过夜；
3．4℃，1000 g，离心3-5 min，去除酒精，用PBS清洗3遍，最后一遍去除PBS；加入300 μL PBS，轻轻吹打，重悬细胞沉淀，加入相应量的Rnase至终浓度100 μg/mL，37 ℃水浴锅中消化30 min；
4．上机前加入PI（5 mg/mL）至终浓度50 μg/mL，避光孵育15 min；孵育完后，过300目细胞筛，上机检测；
5.分析数据。
注意事项
1. PI为致癌物质，避免用手直接接触。
2. 细胞数目应该达到2x104个，细胞数目过少影响实验结果的准确性。
3.铺板的细胞数量以收获细胞时有足够的生长空间来动态调节，现在的流式细胞仪灵敏度很高，不需要太多的细胞。
4. 在制备时，要清洗干净酒精，特别注意清洗过程中细胞的损失。离心次数不宜过多，防止细胞丢失。
5. 可以用未处理的细胞调试流式细胞仪。
6.胰酶不加EDTA
常见问题
Q:酒精固定后细胞难以沉淀下来，导致细胞丢失较多；
A:可适当延长离心时间和转速。
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