材料与仪器

肿瘤组织
培养液 Hanks 胰蛋白酶 EDTA 胶原酶
培养瓶 培养皿 吸管和胶帽 眼科剪 眼科镊 二氧化碳培养箱 超净工作台

步骤

一、取材

人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4 ℃中，但不宜超过24 小时。

二、培养基

肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMI 1640、DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤组织*不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子，有的还需特异性生长因子（如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。

三、成纤维细胞的排除

成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法。

(1)刮除法：镜下观察肿瘤细胞，并在培养瓶或培养皿底部做下标记，再用无菌胶刮刮除无标记区域。

(2)反复贴壁法：肿瘤细胞贴壁速度比成纤维细胞慢，把含有两类细胞的悬液反复贴壁，则成纤维细胞先贴壁而肿瘤细胞后贴壁，来达到分离两类细胞的目的。

取A、B、C三个培养瓶，先于A中接种入两种细胞的无血清培养基悬液，5～20min后轻轻将上清液吸出，接种至B，A中加入*培养基继续培养；培养B中细胞5～20min后，同样方法将上清接种至C，再于C中加入*培养基。次观察三瓶细胞，会发现成纤维细胞A>B>C，C瓶中主要为肿瘤细胞，如需纯化，可反复处理。

(3)酶消化法：成纤维细胞对酶更为敏感，故加入胰酶或胶原酶消化的时候比肿瘤细胞更易于脱落。可于镜下观察消化，待成纤维细胞脱落即刻终止消化，反复处理几次可得较纯的肿瘤细胞。

(4)复苏、传代和冻存同前。

注意事项

1. 肿瘤细胞的培养也应该遵循无菌操作的原则。

2. 肿瘤细胞在体外不容易培养形成稳定的细胞系，故欲获得好的培养效果应采取一些特别的措施，如加入某种特殊的底物，或者加入促细胞生长因子，甚至需要先用动物转嫁接种成瘤以获得更好的活性。

3. 因为某些肿瘤是病毒感染导致，所以肿瘤细胞培养时应注意自我防护。