分子克隆实验的注意事项和经验分享
时间：2024-01-16 阅读：470
简介：
分子克隆（基因克隆/DNA重组/载体构建）技术是一种在分子水平上操作的技术，用于将特定的DNA片段从供体生物中分离出来，然后通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到适合的克隆载体中，并将重组克隆载体引入到合适的寄主体内进行复制与扩增。可以应用于蛋白表达、病毒包装、基因治疗、细胞治疗、mRNA疫苗、RNA干扰、细胞功能等研究。
具体操作流程：
一、聚合酶链式反应（PCR）
DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3'-OH末端，并以此为起始点, 沿模板5'→3'方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
（1）PCR反应基本成分：
①模板DNA
二、线性化载体
三、纯化PCR、酶切产物并连接
将反应结束的产物进行纯化，纯化所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好，目前有多种试剂盒可供选择；
连接线性化载体和PCR产物，可根据DNA连接酶试剂盒说明书设置，对于较大的片段可以选择4℃连接过夜。
四、细菌转化
冰上解冻克隆感受态细胞（DH5α）；取重组产物，加至感受态细胞中，冰上静置30min，42℃水浴热激45s，迅速置于冰上2-3min；加入600μL LB液体培养基,37℃摇菌1h。
PCR正常反应结束后用琼脂糖凝胶电泳进行检测，选择正确条带的菌液加入对应的培养基，37℃摇起来。
注意事项：
②菌落PCR反应程序变性94℃4-5min即可保证外源DNA释放出来。
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