简介：

首先，如果你已经设计了引物，PCR扩增没有条带，请这样做：

使用第一次的PCR产物作为模版（1~2ul即可），再进行一次PCR。

那你要重新学习PCR扩增了！这篇内容，涵盖了实验中可能遇到的PCR扩增问题和详细的解决办法，主要是如何培养问题解决问题的思考能力，你必须要知道！

PCR扩增主要包括以下几个组分：1）引物；2）酶；3）dNTP;4)Buffer;5)CDNA或DNA。注：现今大部分PCR酶试剂盒一般都是酶，dNTP和Buffer的预混液。

因此，需要从引物，酶，cDNA和DNA模版下手，进行分析。

一共有以下三步：

第一步，一定要确定的是-cDNA。

每个基因在不同组织，不同时期中表达量是不同的。首先要确定你的基因在哪个组织，哪个时期表达最高，确认之后就选这些组织和时期，否则很难做出来。

问题：怎么查找目的基因在哪个组织和时期中表达高？

答：1）数据库。例如NCBI数据库。

2）文章。查询你目的基因的别人做过的文章，看看他们使用的什么。

3）新的基因，没有数据库记载，没有报道，什么都不知道。使用几种组织的混合的cDNA.

第二步：检查你的酶

酶的品质（主要是公司的工艺好不好），活性，保质期，buffer的冻融程度都会很大程度影响PCR扩增。因此，换一个酶是相对简单，必须试用的方法。

第三步：最需要实验经验-引物设计

解决了酶和cDNA的问题之后，需要进行最复杂的引物设计。引物设计是灵活的，根据目的的不同而不同。qPCR引物设计因为可以在序列上随机选择,因此可以使用引物设计引物进行设计，在这里我们主要详解基因克隆的引物设计，一般包括CDS的设计，基因区的设计，非编码区的设计等，这些片段的引物设计一般都固定在一段序列上，不能随意更改（GC含量，TM值都只能固定在一个相对范围内），因此需要一定的实验经验和理论基础，以下为详细的解决方法。

1.GC含量低于40%或高于60%,长度不在18-25范围内，会出现引物二聚体，设计的引物不能遵循引物设计的原则怎么办？

答：不是所有的引物都必须遵循引物设计的原则，也不是所有遵循引物设计设计原则的都可以扩增出来。例如：GC含量为65%，长度为28，如果实在设计不了符合原则的，可以以相对符合的设计方式进行，不必全部符合。

2.设计了好几组引物，都不能扩增出来，怎么办？

酶和cDNA都确定好之后，引物仍然扩不出来条带，对于不同的目的可以使用不同的方法。

①对于鉴定目的基因，只是想要确定这个基因的序列，可以这样做：

在引物两端加一段碱基（5‘的序列可以自己设计），改变引物的GC含量，TM值等。

②对于仅需要扩增目的基因，不能在5’端添加碱基的情况，且使用F2/R2不能扩增出条带，可以这样做：

先在CDS两端设计一对引物，先使用F1/R1进行扩增。然后再使用CDS引物F2/R2进行扩增。

③对于表达载体，需要扩增到载体上，可以这样做：

1）先设计CDS区的引物F2/R2扩增，再使用这个PCR产物作为模版，使用带酶切位点（蓝色为酶切位点及保护碱基序列）的引物F1/R1进行扩增。

2）改变所用的酶切位点。

3）换连接方法。如果使用T4连接，可以换成同源重组的方法。

安培生物致力成为推动生命科学进步值得信赖的合作者

  深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技术实力、先进的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业。总部设在广东，服务面向全国。安培生物集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司，旨在为生命科学的发展提供较好的产品与服务。本公司建立了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、信号传导和神经科学等领域的产品供应线，在各个领域内向用户提供较高的水平和质量稳定的产品，安培生物致力于为广大的科研机构、高等院校等客户提供各种产品、技术支持与服务。

可以在第一时间为用户提供比较先进的专业资讯和完备的产品和物流服务。 专业的技术力量使得我们能够为广大用户提供强大的技术支持，深厚的人脉资源使得我们在全国主要城市拥有众多的合作伙伴，安培生物非常荣幸能将世界上先进的高科技产品推荐给国内从事生物学领域科研的老师和同仁。