伤口愈合实验的这个关键步骤，你掌握了吗？

伤口愈合实验是体外研究细胞迁移非常重要的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带，然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察；这些边缘的细胞会开始进行迁移活动，并且覆盖整个无细胞的区域，重新互相接触在一起。本研究中用到伤口愈合的实验，使用TARBP2和pri-miR130b共表达，通过对伤口愈合的速度的影响，得出TARBP2-K52R可以*抑制pri-miR130b对伤口愈合过程的影响。

在文中，使用Ibidi的伤口愈合插件进行了伤口愈合实验。这是一种双孔的硅胶插件，可以放在培养皿中，插件两孔间的孔壁宽度为500μm。将细胞种在插件中，等待细胞贴壁长满后，将插件移除，这样，两孔间的缝隙就是一个无细胞的500μm“划痕”。

                图1  使用ibidi Culture-Insert 2 Well进行伤口愈合测定的实验工作流程

1.实验材料

1) 细胞:    serum starved A549luc stable cell line

2) 实验耗材:   伤口愈合插件培养皿 (ibidi, 81176)

3) 细胞培养基:  DMEM   （Hyclone）

4) 试剂:  Lipofectamine 2000 （Invitrogen）

5) 灭菌镊子

6）倒置显微镜，最好具有自动图像采集系统和用于活细胞成像的顶部培养箱

2.实验步骤

步骤1：铺细胞（图二）

1.将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。

2.在ibidi细胞插件的每孔中加入70μl 3x10 5的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。

3.将细胞在37°C和5％CO2下孵育至少24小时

                  图2   A. 去除培养皿底部的保护胶带。B.C.在ibidi伤口愈合插件中加入细胞。

步骤2：形成“划痕”

1.采用无血清DMEM培养基培养细胞24小时

2.如图三所示，小心的用镊子夹住插件的一个角，将插件移除。

                                 图3   使用无菌镊子移除ibidi 插件

3.移除插件后，要用显微镜检查是否形成合格的“划痕”。

4.小心的用无细胞培养基或PBS清洗细胞，之后加入2ml培养基进行培养。

                           图4   由ibidi插件移除产生无细胞500μm的缝隙

步骤3：采集显微图像分析

1.在显微镜下选取能同时看到“划痕”和两边细胞的视野进行成像，“划痕”的方向比较好是水平或者垂直。

2.采集0h和10h的图像，并且分析每张图的细胞覆盖划痕区的面积。

3.实验结果

如图所示，共表达pri-miR130b和TARBP2-WT（miR130b-WT）比单独表达pri-miR130b（miR130b-con）对细胞迁移更有抑制作用，而将pri-miR130b和TARBP2-K52R（miR130b-K52R）共表达对于细胞迁移基本没有抑制作用了。