实验室如何灭菌?

消毒和灭菌是微生物实验技术中最基本的操作技术，因此从事药品生产、检验的人员均应了解消毒和灭菌的基本概念、两者的关系，各自的应用方法及其意义，操作时应严格执行相关的操作规程，一方面确保生产与检验工作的效果，另一方面也是对自身安全的保护。

消毒和灭菌的概念：

1、消毒：指对病原微生物的繁殖体的致死作用，但不能杀死芽孢等全部微生物，因此消毒是不干净的，不能代替灭菌。凡用于消毒的化学药品称为消毒剂，因此人们也常称消毒剂为化学消毒剂。

2、灭菌：杀灭物体中所有活的微生物（含芽孢）的作用，灭菌是采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。通常用物理方法来达到灭菌的目的。

消毒和灭菌的关系

1、共性：杀灭微生物以控制其污染和防止传播。

2、区别：

消毒灭菌方法

目前常用的消毒灭菌方法多采用物理方法(如干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线杀菌法等)和化学方法(消毒剂、抗生素)两大类。

1.干热灭菌法

干热灭菌法是利用恒温干燥箱内120ºC-150ºC的高热，并保持90-120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的一种方法。主要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，且不易被高温损坏的玻璃器皿、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。用此方法灭菌的物品干燥，易于贮存。酒精灯火焰烧灼灭菌法也是属于干热灭菌的方法之一。在进行动物细胞体外培养工作时，常须利用工作台面上的酒精灯火焰对金属器具及玻璃器皿口缘进行补充灭菌。

2.湿热灭菌法

压力蒸汽湿热灭菌法，它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。高压蒸汽灭菌器的蒸汽压力一般调整为1.0～1.1kg/cm2，维持20～30min即可达到灭菌效果。

3.射线灭菌法

利用紫外线灯进行照射灭菌的方法。紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。紫外线的作用机制是通过对微生物的核酸及蛋白质等的破坏作用而使其灭活。适合于实验室空气、地面、操作台面灭菌。灭菌时间为30min。用紫外线杀菌时应注意，不能边照射边进行实验操作，因为紫外线不仅对人体皮肤有伤害，而且对培养物及一些试剂等也会产生不良影响。

4.过滤除菌法

过滤除菌法是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。过滤除菌法大多用于遇热易发生分解、变性而失效的试剂、酶液、血清、培养液等。目前，常用微孔滤膜金属滤器或塑料滤器正压过滤除菌，或用玻璃细菌滤器、滤球负压过滤除菌。滤膜孔径应在0.22～0.45μm范围内或用更小的细菌滤膜，溶液通过滤膜后，细菌和孢子等因大于滤膜孔径而被阻，并利用滤膜的吸附作用，阻制小于滤膜孔径的细菌透过。

5.化学消毒剂消毒法

化学消毒剂消毒法用于那些不能利用物理方法进行灭菌的物品、空气、工作面、操作者皮肤、某些实验器皿等。

6.抗生素抑菌法

抗生素抑菌法主要用于培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段以及作为微生物污染不严重时的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、链霉素和新霉素等。

不同种类物品及培养物

消毒灭菌方法

1.无菌操作室灭菌

培养材料进行培养、观察或更换培养液时，必须从各方面防止任何污染物进入培养液或容器，所以无菌操作室的灭菌是至关重要的。由于无菌操作室的污染来源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸灭菌。熏蒸是用高锰酸钾+甲醛[(2ml甲醛+1g高锰酸钾)/m3]进行无菌室的灭菌。经常使用的无菌操作室，在每次使用前都应进行地面卫生清洁，并用紫外线灯照射30 min，进行空气灭菌。对超净工作台，每次操作前用紫外灯照射30min，然后用70%～75%酒精擦拭。

2.培养液灭菌

培养液在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌，或在24小时内完成灭菌工序。目前常用过滤除菌法除去培养物操作液和培养液中的细菌。或对培养液中耐热组分先进行高压蒸汽灭菌，然后在无菌室加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后分装备用。使用高压蒸汽灭菌器灭菌时，将分装好的培养液放入底部有一定量(淹没加热管)凉水的高压蒸汽灭菌器内，增压至0.35-0.4kg/cm2时排净灭菌器内冷空气，以便使蒸汽能到达各个消毒部位，保证消毒灭菌干净。然后继续加压加热，当压力表读数达到1.0-1.1kg/cm2为121ºC，保持15-20 min即可。由于消毒灭菌效果取决于温度而不是压力，所以在一定压力下保持较长的消毒灭菌时间是必须的。

3.培养材料的消毒灭菌

采自动物机体的实验材料，携带着微生物及杂质，接种前须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。从动物机体采集的某些组织块，须用消毒剂进行浸泡处理，进行表面消毒。常用消毒剂有过氧化氢(10-12%，浸泡5-15min)、过氧乙酸(0.05%，浸泡30 s-1min)、酒精(70-75%，浸泡2min)。