真空冷冻干燥技术在外泌体方向的应用
时间：2024-11-07 阅读：115
外泌体是纳米级的细胞外囊泡，主要调节细胞间通讯。它们在纳米医学中具有巨大的应用潜力。然而，其分离技术因为昂贵仪器和试剂受到限制。仿生纳米技术为药物、RNA干扰（RNAi）、蛋白质递送和无药物疗法提供强大的支架，极大地影响了生物医学。在大流行期间，纳米技术在世界范围内mRNA疫苗和诊断试剂盒的开发中发挥了重要作用。然而，传统纳米材料在临床的转化因靶点识别能力差和成本高昂从而受到影响。在这方面，外泌体可能是解决上述问题的一个不错选择。
外泌体是细胞外囊泡，大小范围为30-200 nm，几乎所有类型的细胞都会分泌。它们通过携带DNA、RNA、RNAi、蛋白质、病毒、脂质、小分子和可溶性因子等多种有效载荷参与细胞间通讯。这些物质以旁分泌方式从亲本（供体）输送到受体细胞。外泌体继承了有效载荷传递能力，这使它们成为药物输送的理想载体，通过将所需的物质装载在其内部或表面。外泌体也可用作某些疾病的诊断标志物，例如神经退行性疾病和癌症。外泌体还有穿越体内所有生理屏障的能力，以及与血脑屏障（BBB）相关的能力，这在改善脑部疾病或切除脑癌方面存在重大意义。外泌体可以从所有体液中分离出来，包括血浆、尿液、脑脊液、羊水、胸腔积液、腹水、支气管肺泡杠杆、细胞培养等，它们大量存在于所有体液中。基于外泌体的无细胞疗法具有高浓度和易于进入细胞和器官的特点，在生物医学中具有显着的优势。
有几种有效的外泌体分离方法，包括原型超速离心（用于80%的细胞外研究）、通过聚乙二醇（PEG）的密度梯度试剂、尺寸排阻色谱（SEC）和免疫沉淀等。然而，这些方法有一定的局限性，即超速离心机或商业试剂盒的成本高。此外，分离的外泌体样品的纯度、大小和浓度及其功能取决于所采用的分离方法。
冻干（真空冷冻干燥）现在通常用于延长富集外泌体的储存时间。目前，它在外泌体分离中的应用是比较新颖的。有趣的是，大多数外泌体储存缓冲液都有一个维持其结构和功能的方法。例如，4%海藻糖或10% w/v山梨糖醇和蔗糖有利于富集外泌体颗粒的冷冻干燥。同样，理想的pH值为6.5-7.5，氨基酸、谷氨酸和1%FBS对外泌体的冻干过程是有利的，以避免冷冻休克并保持外泌体颗粒的结构完整性。同样，对于细胞培养基，Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）富含葡萄糖，pH值为6.8-7.4，主要富含L型谷氨酸，并补充10%FBS。与冻干的外泌体颗粒储存培养基类似，也就是说细胞培养基可以保护外泌体。因此，基于冻干的技术能够通过冷冻干燥老化的细胞培养基来分离外泌体。然而，我们仍然需要依靠传统的外泌体分离技术进行洗涤。尽管SEC或超速离心可以在一定程度上达到这种效果，但没有一种分离方法可以纯化外泌体样品免受蛋白质污染。
外泌体分离技术的比较研究评估了用于外泌体纯化的各种商业试剂盒的效率、纯度和可重复性及其在血浆和血清样品中的 miRNA 质量。发现血清适合外泌体的分离，并且具有更多种类的外泌体 miRNA。研究还发现，每种分离方法在纯度、外泌体数量和种类含量方面都存在一定的局限性。相比之下，血浆更有利于外泌体分离。对于所有类型的外泌体样本，与商业试剂盒相比，即使是超速离心也受到产量较低的限制，但纯度相对较高。研究表明，外泌体货物的检测和分离取决于所采用的分离程序。基于冻干外泌体的分离方法因其简单性和成本效益而是一种不错的选择。
外泌体扫描电子显微照片，比例尺：200 nm
使用冻干方法分离外泌体，并使用扫描电子显微镜 （SEM） 表征大小和形状。此外，纳米颗粒追踪分析（NTA）用于准确揭示样品中外泌体的浓度和大小。贴壁细胞系和悬浮细胞系的细胞外囊泡平均大小均约为140 nm，这与报道的外泌体大小（30-200 nm）相符。基于蛋白质的外泌体的平均浓度可满足下游应用。一般外泌体表面的蛋白标记物被认为是其表征的标准。例如，CD9、CD63 和 CD81 是内体特异性四跨膜蛋白。CD9首先在从树突状细胞中分离的外泌体上被发现。TSG101和HSP70是转运复合物所需的内体分选复合物（ESCRT）复合物的组成部分，在外泌体生成中起着重要作用。钙联蛋白（Calnexin）是一种内质网标志物，主要被评估为外泌体的阴性对照，主要存在于相对较大的囊泡上，而CD63存在于较小的囊泡上。Western blot试验证实，除钙联蛋白外，所有这些重要标记物都存在于分离的外泌体表面。
外泌体在纳米医学中的应用有利于药物递送和诊断。研究人员通过用达沙替尼和普纳替尼负载这些分离的外泌体来评估这些外泌体的药物负载和释放能力（达沙替尼和普纳替尼被用作Ph+白血病的酪氨酸激酶抑制剂），观察到外泌体可以有效地负载药物并将药物递送至靶细胞。药物释放研究是通过在不同时间点收集样本在体外进行的。在8 h时，药物释放最佳，而在12 h时观察到下降。研究结果证实了这一点，因为K562是一种白血病细胞系，具有较低的pH值，这会触发药物从外泌体释放。
实验样本：外泌体
实验目的：去除所有水分，保持样品美观，方便保存及下一步试验
实验设备：
真空冷冻干燥机Mercury180M
实验过程：
1、打开冻干机预冷，设置好冻干程序包括预冻和升华程序。
2、对样品进行前处理，加入合适的保护剂进行预冻。如葡聚糖，甘露糖，海藻糖，复合保护剂。将样品分装到合适的容器内，放置于冻干机隔板上，Mercury冻干机隔板均匀度达到了±1°C，可保证样品的均一冻干状态。
3、启动设置好的冻干程序，即预冻至-45℃，持续时间5h。升华程序-45℃～20℃，持续时间32h。此步骤可以利用冻干终点判断功能，预估完成时间，可缩短反复查看的时间。
4、程序结束后，释压取出冻干好的样品，观察样品状态是否达到预期。如果达到随即储存或者进行后续实验。
实验结果：无保护剂组，外泌体直接冻干，冻干后比较松散。加入5%甘露醇后样品更为美观，且保存效果好。
冻干前后对比图如下：
冻干前 VS 冻干后
左3为加入甘醇后样品