真空冷冻干燥技术在生物制品中的应用
时间：2024-12-12 阅读：113
采用真空冷冻干燥法保存微生物(如菌种、病毒等)或生物系统(如血液细胞、角膜等)是目前便捷的一种方法。由于冻干药品呈多孔状、可长期贮存、复水性好，且可恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等。从国家食品药品监督管理局数据库得知，目前国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素α2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素α2b、冻干人凝血因子VⅢ、冻干人纤维蛋白原等冻干药品已获准上市。
目前认为冻结过程对细胞的损伤机理主要是溶质效应和机械效应。当细胞溶液的温度降到其平衡冻结点以下一定的过冷度后，细胞外溶液首先结晶，纯水的冻结使细胞间隙内的液体逐渐浓缩，电解质浓度显著增强，溶液的pH、离子强度、渗透压发生变化，导致细胞内的蛋白质变性以及细胞脱水死亡，即所谓的溶质效应。在预冻过程中，细胞内的水分结冰，体积膨胀，细胞内的冰晶生长对细胞膜及细胞器膜产生机械剪切破坏，称为机械效应。冷冻速率越快，胞内冰晶形成的数量越多，机械损伤就越大。此外，冻结过程对细胞冻干效果也至关重要，如果不能提供有效的预冻条件，随后的干燥过程也会加速细胞的损伤和死亡。生物制品的玻璃化保存是避免冰晶生长的主要措施，也是实现生物体低温保存的主要途径。如用海藻糖做保护剂实现了红细胞的玻璃化保存，各项指标均达到临床输注标准。
真空冷冻干燥过程对细胞损伤的两大根源是细胞膜的融合与膜脂质的相转变。在正常生理条件下，细胞膜中的磷脂的极性基团通过与水分子结合而在空间上相互隔开，但细胞膜失水后，极性基团的聚合密度增大，膜上的蛋白质与蛋白质之间、蛋白质与脂类之间发生相互作用，以极性基团间的氢键结合来补偿丢失水分中的氢，导致胞膜融合、破损，内容物外溢。这种强烈的相互作用还导致相转变温度升高，如卵磷脂在水合时的相转变温度约为-7℃，而在脱水时升高至约70℃。故干脂膜在室温下处于凝胶相，很容易发生不可逆的相分离，此外，在复水过程中，处于凝胶相的脂膜会向液晶相转变，造成膜通透性增加，使细胞内外物质自由双向交换，导致细胞代谢紊乱。
所以应寻找适当的冻干保护剂，一方面具有较高的玻璃化温度，在冻结过程中能降低冰晶和溶质的损失;另一方面又能在干燥过程中代替水分子稳定细胞膜骨架，保持其完整性。
对于低温保护作用，液体状态下蛋白质稳定的机理之一是“优先排阻”假说。该假说由Timasheff等首先提出的用以解释溶液中糖类保护作用的机制。他认为糖类不直接与生物分子结构相互作用，而是优先与其表面的水分子结合，使得生物分子表面稳定剂量浓度比溶液中的低，生物分子优先水化，表面张力增加，化学势升高，结构更稳定；而保护剂则优先被排斥在蛋白质区域外（即优先排斥）。专家认为溶液中溶质(稳定剂或去稳定剂分子）与生物分子的优先相互作用包括优先排阻和优先结合。其中优先排阻作用稳定生物分子结构，优先结合作用破坏生物分子结构。溶质对生物分子稳定性的影响取决于优先结合与优先排阻作用的平衡，该平衡与溶质的化学性质和生物分子的表面性质有关。
“优先排阻”假说同样适用于冷冻-融化过程。蛋白质保护剂在溶液中被从蛋白质表面排斥，在冻结过程中能够稳定蛋白质。但是优先作用机理不能解释用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象。
在冻干过程中，由于蛋白质的水合层被除去，优先作用机理不再适用。对于冻干保护机理，仍在研究探讨之中，目前主要有两种:
经研究发现:自然界中存在的、能够在低温脱水状态下存活的有机体细胞内聚集大量的二糖，常见的为海藻糖和蔗糖，故提出“水替代”假说来解释二糖的保护机理。
该假说认为由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子连接。在冷冻干燥过程中，当生物大分子失去结合水膜后，双糖分子中的羟基能在其失水部位以氢键形式与之连接，及时形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，在物理状态上保持与结合水存在时相似，从而保持了生物分子的高级结构和功能，防止蛋白质因冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能的完整性。另外，二糖的存在还有助于降低脂质的相转变温度Tₘ。
如卵磷脂在蔗糖或海藻糖存在下，Tₘ降低至-20°C，比水合的卵磷脂的Tₘ低10°C，比无海藻糖干燥的卵磷脂的Tₘ低90°C，这样干膜脂质在室温下是液晶相，避免了相分离的发生，且在复水过程中也不会发生相转变和脂质双分子层的泄露。
所谓玻璃化主要是指液体转变为非晶态(玻璃态)的固化过程。玻璃化固体分子之间的距离与液体分子间的距商没有区别、不形成冰晶。研究发现在玻璃态下，物质兼有固体和流体的行为，黏度高，不容易形成结晶，且分子扩散系数很低，因而可将细胞膜的蛋白质分子支撑包裹起来，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使蛋白质物质的链段运动受阻，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。
该假说认为玻璃化是在冻干过程中保护生物材料的要求。玻璃化能够在冻结过程中避免形成冰晶，从而可避免冰晶和溶质损伤等冻结损伤;其次，处于玻璃态的物质具有高的黏度，一般为10¹²~10¹⁴ Pa·s，当玻璃化的保护剂包围在生物分子的周围时，大分子物质的分子运动和分子变性反应变得非常微弱，阻止了膜融合等由分子扩散运动造成的损伤。所以为最大限度保持细胞的活性，应保证细胞在整个冻干过程中始终处于玻璃态，即低冻结温度和干燥温度应始终低于系统的玻璃化温度T’g。T’g较高的糖类和高聚物有海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖等，其中海藻糖的T’g较高，对冻干产品的保护作用更强，保存时间更长。
对于细胞的保护，氢键和玻璃化都是必需的，所以两个假说并不互相排斥。举个典型的例子具有较高T’g，葡萄糖能够与膜基团直接相互作用，单独使用时均不能阻止干态下脂质膜的泄漏，但两者的组合使用能有效地保护脂质膜。所以，在血液细胞的冷冻干燥保存中宜采用二糖和高聚物组合作为冻干保护剂。
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