一个典型的转染过程涉及3-4个步骤：货物包装，跨膜转运，细胞内释放，转运进入细胞核。货物的位置很大程度上影响它们是否能够履行其预期的功能。例如，对于基因编辑，货物必须定位在细胞核。因为对于长期稳定的基因表达和基因编辑，货物必须进入细胞核，并整合入基因组中，因此货物的定位可视化将会非常有用。另外，对于siRNA介导的基因沉默或蛋白瞬时表达，药物必须被递送进入细胞质中。荧光共聚焦显微镜是最直接的和普遍使用的评估货物定位的方法。货物通常用荧光染料染色，细胞核用DAPI染色，从而可视化荧光信号的共定位。可以通过一些方法改善货物在细胞核的定位，如使用细胞核定位信号和微管相关序列。

在转染过程中，T细胞可能会经历不同程度的扰动，进而影响它们的关键生理特性，如基因表达。评估细胞扰动有以下几种方式。钙离子调节不同的细胞功能，作为第二信使参与多种细胞通路活动。细胞质中的钙离子水平通常维持在100*10^-9M，远低于在内质网和线粒体及细胞外环境的钙离子水平（两者分别在µM和mM范围）。细胞内荧光钙水平的持续增加是细胞压力的表现，可能会引起应激反应相关的信号通路。在转染过程中，货物通过机械穿孔或电流渗透的方式被引入细胞。这些过程在细胞膜上形成了孔道，钙离子将会顺着浓度梯度进入细胞质中。细胞内钙浓度的水平的增加和高水平的持续时间是膜孔恢复稳态所需时间的指标。一种定量评估钙压力的方法是使用荧光指示剂，如Fura-2，Indo-1和Fluo-4，并计算荧光扣除背景荧光之后的变化。另一种观测细胞内钙水平的方法是通过使用基因编码的荧光蛋白，如基因编码的钙指示剂（GCaMP）。相比化学指示剂，基因编码的荧光蛋白不会造成细胞毒性，更适合长期观测，但挑战是质粒构造必须被优化以确保蛋白可以稳定表达。

稳健的T细胞激活是细胞快速扩增的先决条件。T细胞早期激活标志物CD69可用于确定是否该生物特性被转染影响。活化后，T细胞分泌一系列的效应细胞因子，如IL-2，TNF-α，IFN-γ（可以通过ELISA试验检测）。另一个更复杂的方法，多参数细胞因子染色不仅可以用于测定细胞因子的产生，还可以测定特定细胞亚型的功能标记分子。但该实验方法的缺点是灵敏度低，需要大量的实验方案优化。

抗原特异性的T细胞可以增强疗效和确保安全性。MHC多聚体技术可以用于测量修饰后的CAR受体/T细胞受体（TCR）和递呈在MHC分子表面的特定肿瘤抗原之间传导的免疫信号。这种单细胞试验使用多种MHC-I或MHC-II分子亚基（二聚体到八聚体）分别验证与表达CAR的CD8+或CD4+TCR之间的免疫作用。常用的四聚体技术是将四个生物素化肽-MHC糖蛋白链与链酶亲和素主链连接在一起。

实体瘤对于CAR-T疗法仍然是一个巨大的挑战，一个挑战是CAR-T细胞的肿瘤浸润性差。T细胞能够响应生物分子迁移，而T细胞的迁移是一个非常重要的考量，因为T细胞对化学引诱剂的敏感性和迁移能力影响它们的效力，尤其是对实体瘤的效力。如果T细胞可以在实体瘤里迁移更快更均一，将可能实现更好的临床效果。Transwell试验是评价细胞迁移的常用方法，该方法使用一个填充了两种介质的小室，一种介质是趋化因子如IP-10，另一种是结合了CXCR3受体的化学引诱剂，通过多种膜分开两种介质。T细胞培养在小室上层，一旦感知到趋化因子的化学梯度，将会迁移到小室下层。培养一段时间后，上层小室被移开，迁移到膜上的细胞数量可以在显微镜下通过血球计数确定。膜孔的大小需要谨慎选择，避免细胞的非特异性转移。如果使用了荧光标记的T细胞，可以通过荧光显微镜观察随时间变化的迁移行为。