听老师将讲HPLC的计算

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HPLC中涉及到计算的，主要是流动相配制和含量计算。RP-HPLC一般用缓冲盐配合甲醇乙腈作为流动相，计算主要涉及到如何配制流动相的问题。同时还要考虑到流动相配制的数量问题。HPLC计算主要运用外标法。内标法在HPLC分析中，运用不多。所以略讲。

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1、流动相配制的计算

流动相在HPLC中起到运输样品的作用。而流动相准确地配制，在HPLC测试中有着重要的作用。准确地配制流动相能够保证测试中保留时间的重复性。所以，配制起来不能掉以轻心。

对于流动相配制，我把它概括为以下几个字。

计算，称量，溶解，调节，<混合>，过滤，脱气。为什么我把“混合”外加了个框呢？这就是涉及到你的设备是否是单元泵还是多元泵的问题了。如果只有一台单元泵，也无电磁阀切换功能的泵，需要混合这个步骤，而多元泵，或者低压梯度切换的，可以不需要所谓的混合。各走各的。

打个比方说，如果我的流动相是：甲醇：纯水=60：40（v/v），对于单元泵，那么只能甲醇和纯水混合，作为流动相，而多元泵或者多元梯度泵，则可以有两路，A路放甲醇， B路放纯水，A与B各比例控制为60%，和40%。

对于HPLC 配制流动相，要保证流动性配制准确，也要保证流动相配制足量，不多不少，这样保证在这批测试中，流动相不至于不够，也不致于太多而浪费，流动相一般需要在2-3天内用完。那么首先确定流动相要配制多少。举一个例子。

例

要分析30个样品，10个对照品，样品和对照品都分析2次。一个试样分析20分钟，流速为1.2ml/min。那么我要配制多少ml的流动相呢？通过计算来解决。（注：自动进样，连夜分析，可以设置停止泵程序）

一般来说，试样设置20分钟，还需要考虑进样的时间。假设进样时间为三分钟，那么一个试样所需要的时间为23分钟。我们可以计算：

根据计算，需要配制2208ml流动相。对于流动相，我们不能配制得太抠，需要考虑到吸滤头占的空间，那么我们再多配制个100-300ml，这取决于你的瓶底胖瘦。能够保证不被吸空为宜。那么我们就配制2500ml吧。

对于流动相如何配制，我们给一个实例

比如我要测试中药一清胶囊，我们翻阅中国药典，得以下信息。

一清颗粒是由黄连，大黄，黄芩（qin）组成。一般用于清热泻火解毒，化瘀凉血止血。用于火毒血热所导致的身热烦躁，目赤口疮，咽喉牙龈肿痛，大便秘结，吐血，咯血咽喉炎，扁桃体炎，牙龈炎等上述症候者。

其中黄芩主要成分黄芩苷用HPLC方法测试。先摘入如下：

色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（pH=2.7）(42:58 v/v)为流动相，检测波长为275nm。有效塔板数按黄芩苷峰计算不低于5000

我们看到，其流动相是：甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（pH=2.7）(42:58 v/v)，那么也就是说有水相识0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，其pH=2.7（用磷酸调节），有机相是甲醇。

要注意，对于HPLC用的试剂，水，溶剂，都是需要好的。试剂一般在分析纯以上。最好用优级纯，溶剂一般用HPLC级别。水用超纯水。所有的溶剂，溶液，都需要用0.45微米（或更细）的微孔滤膜滤过。也要保证溶剂瓶清洗干净。干燥。

流动相脱气是很重要的，现在一般的仪器都有在线脱气。当然，在配制流动相前脱气，亦重要。一般脱气又抽真空脱气，超声波脱气，吹He脱气，加热回流脱气等。常用的是前两个脱气方法。当然，抽真空脱气效率比较高，但是要注意有机相是否在抽真空后比例改变的问题。所以，对于混合两相的流动相，最好单独滤过，再混合。混合后一般会产生气体，用效率略低的超声波脱气即可。超声波脱气，只要看到无明显气泡即可使用。

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二．含量计算

对于HPLC，我们一般使用外标法计算。那么有同学问，那么为什么内标法很少在HPLC上使用呢?

那么我们看下气相色谱和HPLC不同的进样方式。GC手动进样还是依靠进样针的定量进样，因为进样量很少，以微升计，所以，稍稍不留神，就有可能多进或者少进样。而且，进样针上的刻度也很粗，所以，GC用手动进样，使用外标法确实很考验测试者的娴熟技巧和过人的眼力。而内标法在GC进样测试中，由于内标物的调节作用，可以使得由于进样误差降低到最小，其相关的文章，查阅qinqingcao在本论坛的文章。但是HPLC进样是六通阀进样，其有一根定量环，如果手动进样能够保证定量环是充满样品溶液的，那么进样误差就几乎不存在。况且内标法需要寻找合适的内标物质，同时配制内标物，比较麻烦，所以在HPLC中很少听说用内标法定量计算。更多的，是使用外标法计算。

所以，HPLC手动进样一般使用3倍量的定量环进样。也就是说，20微升的定量环，我要注入60微升以上的样品溶液。保证定量环中充满着样品溶液。而多余的样品溶液会被排除。这样保证每次进样都是定量环中的那些量。对于定量环，这个体积一般也不是正好是20.00微升，但是我们保证进样过量（多余的溶液会被排出），则能够保证进样都是按照定量环中的体积进入色谱系统，这样消除进样的误差。对于定量环，在做完样品后需要用无溶质的流动相清洗数遍。如果定量环真的很脏，无法清洗了，那么可以裁剪一段管径和定量环相同的干净的不锈钢管，裁剪长度和定量管相同，安装上去。当然资金充裕的话，也可以购买厂家的定量环。

当然现在自动进样器很普及，那么使用自动进样器就更加方便了。

对于外标法，实际上也就是用已知浓度的对照品（标准品）来对样品中的该物质。这实际上很象砝码和天平。标准品就如同砝码，在同样的色谱条件下，标准品的峰面积和浓度已知，而样品中的峰面积可以测试出来，这样通过比例式子比较出样品中该物质的浓度了。

在这里，我想和大家说明的是，一般是通过保留时间做定性的。比方说，我测试维生素C，维生素C标准品在一定的色谱条件下，其保留时间为2.4分钟；样品在同样的色谱条件下，2.4分钟有峰，一般认为是样品中也许有维生素C。当然，保留时间定性确实有其局限，但是没有其他手段，那么保留时间还是能够发挥定性的作用。

对于定量，外标法定量，如果做的准确的话，需要用多点（浓度）定量。然而在企业用单点法定量还是很多的。对于做线性，精密度，回收率，这些内容我们在方法学验证中讲授，这里我还是着重讲解单点法校正。

在讲单点法校正，我先问同学们一个问题，如何用简单的方法来测试校园中的树高度？

通过一根已知高度的biao杆，在太阳下投射在地面的阴影的长度，计算出树的高度。同样道理，我们也是用已知的标准品的浓度和峰面积，用样品中同一物质的面积，计算出样品中的那个物质的浓度。根据稀释倍数计算出样品中，该物质的含量。

如果与标准曲线联系起来，这个就是单点法。也就是说，以0为圆心，标准品浓度和面积在二元坐标的一点的连线作为校准曲线。得y=ax 其中的a就是斜率，也就是面积随着浓度的变化而变化，其变化率为a。

那么样品浓度的计算，就是按照其峰面积在坐标上的点，对应的浓度。用以下公式计算。

单点法：

我们给出一个例题。

例

测试果汁中维生素C含量。配制20mg/100ml的维生素C作为标准品。称取20.005g果汁到50ml容量瓶中，加入流动相溶解定容摇匀。滤纸过滤。吸取滤液10ml到50ml容量瓶中。流动相定容摇匀。标准品和样品均吸取20μl进色谱，分别得到峰面积24336（标准品），20129（样品）。计算果汁中维生素C含量（mg/100g）

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