分子实验-免疫荧光基本实验步骤（基本步骤与技巧）

　　免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

　　免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其他方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外，抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

　　由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

　　免疫荧光实验基本实验步骤：

　　细胞准备

　　对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

　　固定

　　根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮钠的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3*5次。

　　通透

　　使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3*5min。

　　封闭

　　使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。

　　一抗结合

　　室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。

　　二抗结合

　　间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

　　封片及检测

　　滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

　　免疫荧光实验步骤技巧

　　封闭:

　　将组织切片自-20℃冰箱取出，室温静置15 min（可采用免疫荧光封闭用笔在组织周围画圈以避免抗体扩散），随后采用1×PBS洗三次，每次5 min，最后采用blocking buffer（绵羊血清5%，0.3%Triton-100，采用1×PBS稀释可得）室温封闭1 h。

　　一抗孵育：

　　滤纸吸掉玻片上的封闭液（吸取的时候要注意不要碰到组织样本），并滴加blocking buffer配置的待测抗体，将玻片置于湿盒中，4℃孵育过夜。既然是湿盒，应该都知道里面要加水防止抗体蒸发的吧，嗯嗯，聪明的你们肯定知道。

　　二抗孵育：

　　第二天把湿盒从冰箱拿出来(一般来说大部分的染色可直接做下面的步骤，如果待测蛋白比较难染色，可将湿盒置于室温继续孵育一段时间，时长自己定)，回收一抗(土豪的话就随意)，1×PBS滴加到玻片上，洗三次，每次3 min，随后吸取多余的1×PBS。

　　接下来所有的操作均在避光条件下进行，这很重要！

　　滴加二抗（同样用blocking buffer配置哦），室温孵育1 h。

　　染核：

　　吸掉二抗，滴加DAPI孵育3-5 min，1×PBS同上方法洗三次。

　　最后用滤纸吸取多余的液体，用含有抗淬灭剂的封片剂封片（有小伙伴用指甲油，也行），避光保存后即可在显微镜下观察染色的情况。