概述
 

　　为了在不同的组织中导航，迁移细胞必须平衡持续的自我推进运动与规避障碍的适应性行为。我们确定了类免疫细胞躲避障碍的曲率传感机制。具体来说，我们提出，在质膜向内弯曲的区域中，曲率敏感的 BAR 结构域蛋白 Snx33 会抑制迁移细胞前进边缘的肌动蛋白聚合。这种机制的遗传扰动降低了细胞逃避障碍的能力，同时细胞在无障碍环境中迁移得更快、更持久。我们的结果展示了细胞如何读取其表面形貌并利用肌动蛋白和质膜生物物理学来解释其环境，从而使它们能够适应性地决定是否应该前进或转身。根据我们的发现，我们提出 BAR 结构域蛋白的天然多样性可能允许细胞调整其曲率传感机制以匹配其环境中的形状特征。
 

　　介绍
 

　　细胞迁移驱动许多发育、生理和病理过程。虽然推进机制已广为人知，但仍不清楚细胞如何引导其运动以导航复杂和动态的环境1并绕过组织内的障碍2 , 3。这些适应性行为对于快速且动态的细胞类型尤其重要，例如免疫细胞和传播肿瘤细胞。基于肌动蛋白的突起和起泡之间的切换已被证明有助于细胞发育中的控制4，但细胞通常仅表现出富含肌动蛋白的突起，例如片状伪足和褶边。它们需要足够长的寿命，以便细胞能够探索并持续地在周围环境中移动，同时又足够“不稳定”，以便它们在遇到障碍时能够适应并改变方向5 , 6。
 

　　在迁移过程中，细胞的最外层边界(质膜)因微环境的变化而变形。然而，目前尚不清楚膜曲率是否编码细胞用来选择其迁移路径的信息7、8，或者膜形貌是否只是作用在细胞表面的力的副作用。许多迁移细胞确实表达多种曲率感应蛋白，它们可以直接与质膜和下面的肌动蛋白细胞骨架相互作用9。特别是，BAR 结构域蛋白家族可以促进膜曲率传感。这些蛋白质形成新月形膜结合二聚体，可以感知和产生曲率9、10、11，并且已知通过几个辅助结构域与肌动蛋白细胞骨架的调节因子(例如 Arp2/3 复合物、福尔明或 Rho GTPases)相互作用9、12。事实上，表面形貌的变化会诱导一些胞质 BAR 结构域蛋白募集到高度正(向内)曲率的区域13，并且可以触发肌动蛋白结构和内吞热点的形成14、15。在这里，我们发现曲率感应 BAR 结构域蛋白 Snx33 抑制肌动蛋白聚合并重新排列 WAVE2 的定位，以限制前缘的持续存在并引导迁移。通过这种机制，Snx33 允许细胞自适应地决定是否应该向前移动或转身离开。
 

　　结果
 

　　Snx33 优先被排除在迁移细胞前缘的向外弯曲的膜区域之外
 

　　在分化过程中，类免疫HL-60细胞的基因表达发生显着变化，启动快速迁移，并获得复杂的膜形貌，类似于体内骨髓中发生的情况16(补充图1a  )。终末分化的运动细胞(dHL-60 细胞)在前缘显示出富含肌动蛋白的板状伪足和膜皱褶(图 1a、b)。为了更详细地分析膜形貌，我们使用扫描电子显微镜(SEM)来观察天然固定细胞膜的超微结构细节，并使用偏振全内反射荧光显微镜(p-TIRFM)来探测活细胞中的膜曲率动力学。我们观察到弯曲的膜图案，如通过 SEM 在上部质膜中看到的那样(图 1c)，这是非常动态的，如通过 p-TIRFM 在基底质膜中观察到的那样(图 1d，补充图 1b-d和补充视频 1 )。
 

　　图 1：片状伪足和曲率敏感蛋白 Snx33 的曲率图案。
 

　　a迁移细胞的前缘具有复杂的曲率模式。箭头表示细胞运动的方向。线条描绘了复杂的 3D 环境。b延时明场成像显示免疫样分化的 HL-60 细胞的迁移。c野生型细胞的扫描电子显微镜 (SEM) 图像，前缘放大。n  = 175。d p-TIRFM 成像的延时 p 偏振显示前沿的动态膜波。e分化(迁移)和未分化(非迁移)HL-60 细胞之间上调(橙色)和下调(蓝色)BAR 结构域基因。f细胞中 z 平面上部(靠近细胞顶部)和下部(近表面平面)的荧光标记 Snx33 (eGFP-Snx33) 和膜标记( CAAX-mcherry)。g通过共焦显微镜获得的不同高度的荧光标记的 Snx33 和膜标记的皮尔逊相关系数。n  = 10。误差线表示平均值的标准误差。h使用 AlphaFold 多聚体(绿色)建模的 Snx33 PX-BAR 结构域的结构与不完整晶体结构(PDB ID：4AKV；灰色)的比较。i在 PX-BAR 质心(绿色，平均曲率PX-BAR  = 16 μm -1)和随机脂质磷酸位置(黄色)采样的平均曲率 (H) 的概率直方图。显示了平滑分布的核密度估计。平均值表示为垂直虚线。j具有 PX-BAR 域的屈曲膜的粗粒度模拟快照的俯视图和侧视图。显示了蛋白质主链珠(绿色)、磷酸盐珠(黄色球体)和脂质尾部(灰色棒)。为了清楚起见，省略了水和离子。显示了俯视图和侧视图。指示各个帧的时间点。k , l使用点阵光片显微镜观察迁移细胞的横截面 ( xz )，放大膜皱边 ( k )和片状足 ( l ) 上的 eGFP-Snx33 和 CAAX-mcherry 进行可视化。n  = 6。m Snx33 相对于质膜开和关褶皱的平均z位置的量化( p TopMembrane  = 0.01635，t  = -3.5524，df = 5，配对，两侧)。n  = 6 个单元，其数据是从双色 3D 电影中获得的。每个点代表 1 个单元格的平均值。比例尺 = 10 μm。p < 0.05 (*)。
 

　　这些弯曲的膜图案可能构成曲率敏感蛋白的结合位点，例如来自 BAR 结构域家族的蛋白。为了从这个大家族中识别出能够感知凹进障碍并因此与细胞迁移过程中的适应性行为相关的候选者，我们测量了 HL-60 分化为迁移状态(即曲率较差(原始细胞为原始细胞))之前和之后的表达谱。均匀圆形)与曲率丰富的状态(补充图 1a)。BAR结构域蛋白Snx33的表达在此分化过程中增加了16倍(图 1e)。我们在荧光标记(eGFP-Snx33)后通过共聚焦显微镜对其亚细胞定位进行成像，发现Snx33在整个膜皱褶处富集(图 1f，g)，即dHL-60细胞前缘的高度弯曲结构。基于其蛋白质家族内的相似性，与 BAR 亚组9的许多其他 BAR 结构域蛋白质相比，Snx33 预计会结合浅曲率。Snx33(PX-BAR)的膜结合结构域在凸面上包含一个带正电的斑块，这强烈表明该表面上存在向内曲率依赖性膜结合(补充图2a-d  )。为了更详细地评估其曲率传感特性，我们对具有质膜衍生脂质成分的屈曲膜上的 PX-BAR 结构域(图1h-j)进行了长的粗粒度分子动力学(MD)模拟(表 S1；详细信息请参见方法)。这种计算分析已被广泛用于表征多种蛋白质17、18(包括其他 BAR 结构域19 )的曲率传感特性。在 30 µs 长的模拟过程中，Snx33 的 PX-BAR 结构域仍然与膜紧密结合，并表现出对具有向内局部曲率的膜区域的强烈偏好(图 1i，j，补充图 2e  ， f  )。Snx33 将质膜与赖氨酸和精氨酸等碱性残基表面结合，介导静电相互作用(补充图 2a –d、3a、b、4a–g，详细信息请参阅 补充讨论)，这对于质膜结合很常见20 . 为了进一步测试 Snx33 在细胞中的曲率敏感性，我们通过晶格光片显微镜对其亚细胞定位进行了成像，并且支持我们的 MD 模拟，我们发现 Snx33 被排除在褶边和片状伪足边缘之外，这两种结构都具有高度负性(向外)曲率(图 1k-m，补充图 5和补充视频 2，有关详细信息，请参阅方法)。为了证实 Snx33 的排除，我们将其定位与 IRSp53(也称为 BAIAP2)(一种典型的向外曲率结合蛋白)的定位进行了比较21。如前所述，在中性粒细胞样细胞中，IRSp53 积聚在前进纤维和回缩纤维22、23的，即已知的向外弯曲结构(补充图 6a-c和补充视频 3)。总而言之，我们表明，含有 BAR 结构域的蛋白质 Snx33 对具有向内局部曲率的膜区域有强烈的偏好，并且在前缘富集，但被排除在向外弯曲的膜结构之外。
 

　　Snx33 控制前沿生长并调节质膜张力
 

　　为了研究 Snx33 在适应性迁移中的作用，我们使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑生成了 Snx33 敲除 (Snx33-/-) 细胞系(补充图 7a、  b)。免疫样细胞中的推进取决于细胞前缘肌动蛋白的活性聚合24、25。鉴于细胞形状反映了运动驱动的富含肌动蛋白的突起26的变化，我们对选定的细胞形态参数(即细胞铺展、细胞偏心度和前沿特征)进行了定量和公正的比较。由于免疫细胞在短时间内改变其形态，我们对延时电影进行平均以捕捉它们的动态。为此，我们在 ilastik 27中训练并使用基于机器学习的算法来分析全内反射荧光显微镜 (TIRFM) 成像的细胞影像(详细信息请参阅方法)。Snx33-/-细胞扩散到更大范围，并表现出更细长的形态和更大的前缘(图 2a-f，补充图 8a-e和补充视频 4和5)，与基质的粘附无关(补充图 8f-i)。此外，可以通过表达荧光标记的Snx33来挽救扩散面积和前缘面积的增加，证明观察到的表型的特异性(补充图 8b，c)。总而言之，这些结果表明 Snx33-/- 细胞在迁移过程中具有更稳定的前缘。
 

　　图 2：Snx33 敲除细胞由于肌动蛋白聚合增加而表现出细胞和前缘形态的改变。
 

　　野生型和 Snx33-/- 细胞的 TIRFM 图像。b细胞扩散面积(p  = 1.505e-7，Mann–Whitney- U检验，两侧)和c运动过程中野生型和 Snx33-/- 细胞之间的偏心率不同(p  = 0.004989，Mann–Whitney- U -测试，双面)。d野生型和 Snx33-/- 细胞的前缘分割。时间范围(5 秒)采用颜色编码。e前沿面积(p  = 1.634e-5，Mann–Whitney- U检验，两侧)和f长度(p  = 0.2111，Mann–Whitney- U检验，两侧)。n  = 82(重量)，n  = 78(Snx33-/-)。g静态系绳拉动实验示意图。h 来自 3 个独立实验的 wt ( n  = 24)、Snx33-/- ( n  = 26) 和 Snx33-/- 与过表达 eGFP-Snx33 ( n = 25)的平均静态系留力( p wt 与 Snx33-/-  = 7.883e-6，t = −5.0144，df = 47.376；p wt 与 Snx33-/- + eGFP-Snx33  = 0.2141，t  = −1.2601，df = 45.515；p Snx33-/- 与 Snx33-/- + eGFP-Snx33  = 0.2141，t  = -1.2601，df = 45.515，两侧)。i通过流式细胞术定量固定 wt 和 Snx33-/- dHL-60 细胞中鬼笔环肽荧光强度的中值。来自 3 个独立实验的数据(p t00  = 0.184，Mann–Whitney- U检验，双边；p t01  = 0.0373，t  = −4.26，df = 2.375，双边；p t30  = 0.1298，t  = -1.9728 ，df = 3.5035，两侧)。j全长 Snx33 及其结构域和两个 Snx33 截断(ΔPXBAR 和 PXBAR)的示意图。免疫共沉淀实验中比较 Snx33-/- 与 Snx33-/- + GFP-Snx33、Snx33-/- + GFP-Snx33ΔPXBAR 和 Snx33-/- + GFP-Snx33PXBAR 的火山图。富集命中(limma p值 ≤  0.01，倍数变化 ≥  50%)显示为绿色，其余为灰色。比例尺 = 10 μm。p  < 0.001 (***), p  < 0.01 (**), p < 0.05 (*)。箱线图：下铰链和上铰链对应于第 25 个和第 75 个百分位数。上部须线从铰链延伸至最大值，但不超过 1.5*IQR。下部须线从铰链延伸至最小值，但不低于铰链的 1.5*IQR。胡须之外的数据：黑点。黑线：中位数。黑点：意思。
 

　　已知持续迁移过程中前缘生长和细胞扩散增加会增加质膜张力28 , 29。为了测试由 Snx33 损失引起的更稳定的前缘是否会导致更高的膜张力，我们使用原子力光谱法通过静态系链拉力在前缘测量了它，其中质膜系链保持恒定长度直到断裂(图 2g )。我们发现Snx33-/- dHL-60细胞中的静态系绳力显着增加(从61.58到75.25 pN，图 2h)，这对应于表观膜张力几乎增加了50%(从177.87到265.62 μN/ m；有关详细信息，请参阅方法)。此外，膜张力的增加可以通过稳定表达荧光标记的Snx33来挽救，排除Snx33独立功能作为该表型的起源(图 2h)。值得注意的是，Snx33-GFP在野生型背景上的过度表达并没有降低膜张力，这表明功能的获得不足以改变前缘或其对膜力学的影响(补充图9a  )。最后，这些表型不是分化缺陷的结果，因为中性粒细胞分化标记物 CD11b 在 Snx33-/- 细胞中不受干扰，也不是 CRISPR/Cas9 技术生成细胞系引起的潜在脱靶效应的结果(补充图 9b  ， C)。总而言之，这些结果证实 Snx33-/- 细胞具有更稳定的前沿，显示出持久迁移所需的所有特征。
 

　　Snx33 调节肌动蛋白聚合
 

　　我们的研究结果表明，曲率感应蛋白 Snx33 负向调节肌动蛋白聚合，从而限制前缘尺寸。因此，我们通过流式细胞仪添加趋化剂(fMLP)后通过鬼笔环肽染色定量丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)的量，并观察到与野生细胞相比，Snx33-/-细胞中F-肌动蛋白的总量显着增加-型对应物(图 2i)。这表明 Snx33 对肌动蛋白聚合发挥抑制作用，特别是在刺激后的最初爆发期间。但是 Snx33 是如何抑制肌动蛋白聚合的呢？一些 BAR 结构域蛋白通过直接结合肌动蛋白或通过招募激活肌动蛋白相关蛋白 2/3 (Arp2/3) 复合物的成核促进因子 (NPF) 来重塑肌动蛋白9 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34。为了了解 Snx33 如何抑制肌动蛋白聚合，我们在敲除背景中共免疫沉淀全长 GFP-Snx33 及其结合伴侣，然后进行质谱分析。由于BAR结构域蛋白之间普遍存在分子内自抑制相互作用，因此我们还对含有或缺失PX-BAR结构域但跨越全长蛋白的Snx33的两个截短物进行了共免疫沉淀(图2j  )。Arp2/3复合体的几个成员以及加帽蛋白的两个亚基与Snx33共免疫沉淀(limma p值 ≤0.01  ，倍数变化≥50%)(图2j)。特别是，我们在全长 GFP-Snx33 或其截短物中发现了 ARPC2、ARPC4-TTLL3、ACTR2、ACTR3、CAPZA1 和 CAPZB1 的正倍数变化，表明 Snx33 与 Arp2/3 复合物和加帽蛋白结合。Arp2/3 复合体是肌动蛋白成核剂，负责中性粒细胞前缘的片状伪足和皱褶形成35，而加帽蛋白通过与肌动蛋白丝结合来终止肌动蛋白丝的生长，并通过 Arp2/3 复合体增强其分支36，37、38、39。_ _ _ _ 有趣的是，我们可以观察到，与全长蛋白相比，一些 Arp2/3 组件和加帽蛋白亚基的任一结构域都显着富集(补充图 10a)，这表明 Snx33 的不同结构域以不同的亲和力结合它们，可能 是因为自抑制相互作用可能会遮挡结合位点或影响膜结合，如其他 BAR 结构域蛋白的报道40 , 41 , 42。总之，Snx33 可能通过调节 Arp2/3 复合物和/或加帽蛋白来负向调节肌动蛋白聚合。
 

　　Snx33 影响 WAVE2 定位和褶边形态
 

　　WAVE2 是中性粒细胞中 Arp2/3 复合体上游已知的肌动蛋白 NPF 24、35。因此，为了进一步表征 Snx33-/- 细胞的前缘，我们在 TIRFM 迁移过程中对 WAVE2 复合体 (Hem-1) 的一个组成部分(以下称为 WAVE2)进行了成像(图 3a 和补充 视频6 和7 )。WAVE2 因其在细胞迁移过程中定位于基底膜上的波而得名24。为了产生这样的模式，WAVE2 波在其尾迹中沉积一种抑制剂，暂时抑制 WAVE2 募集24。有趣的是，聚合肌动蛋白是这种抑制反馈的关键组成部分，但调节 WAVE2 与膜结合并决定其斑块形态的因素仍然知之甚少43。因此，我们使用基于机器学习的分割来量化 WAVE2 模式特征。引人注目的是，Snx33-/- 细胞的 WAVE2 面积及其质膜斑块的大小增加了 40%(图 3b-d)。为了确定这是由于 WAVE2 成分表达水平的差异还是由于膜结合增加所致，我们进行了 RNAseq。与对照细胞相比，我们观察到 Snx33-/- 细胞的表达没有差异或有非常微小的差异(补充图 10b)，这表明 Snx33 影响 WAVE2 复合物的定位而不是其表达。这是特别有趣的，因为迄今为止，仅报道了非常剧烈的 WAVE2 补丁表型，这导致迁移能力严重破坏44 , 45。接下来，我们试图测试 WAVE2 斑块形态变化与前沿形态的功能相关性。为此，我们从SEM图像中量化了有效褶边波长，并观察到与野生型细胞相比，Snx33-/-细胞的褶边排列明显不那么紧密(图3e，f，补充图8j， 补充图 8j ) .  11a ). 最后，为了确定有效皱边波长的增加是否仅仅是 Snx33-/- 细胞膜张力增加的结果，我们对 PLD2 敲低 (KD) 细胞进行了 SEM，该细胞也显示膜张力增加44。值得注意的是，与 Nonsense 细胞相比，PLD2 KD 细胞的有效褶皱波长没有差异(补充图 11b、c)。这些发现将 Snx33 确定为膜形状与调节膜形状的肌动蛋白聚合因子之间的联系。
 

　　图 3：Snx33 敲除细胞中 WAVE2 图案宽度和褶皱波长增加。
 

　　野生型和 Snx33-/- 细胞的 TIRFM 图像显示了 WAVE2 的分布，WAVE2 是中性粒细胞中 Arp2/3 复合物上游的肌动蛋白成核促进因子。b前缘 WAVE2 斑块占据的总面积在 Snx33 丢失后增加(p  = 0.000408，Mann–Whitney- U检验，两侧)。n  = 82(重量)，n  = 78(Snx33-/-)。c野生型和 Snx33-/- 细胞中动态 WAVE2 斑块的分割。时间范围(5 秒)采用颜色编码。d当 Snx33 丢失时，WAVE2 斑块的大小会增加(p  = 0.000464，Mann–Whitney- U检验，双面)。n  = 82(重量)，n  = 78(Snx33-/-)。带有皱褶分割的 SEM 图像(红色)显示了分布第50 个百分位数的野生型和 Snx33-/- 细胞的前缘。f有效褶边波长随着 Snx33 的损失而增加(p  = 3.171e-7，Mann–Whitney- U测试，双面)。n  = 175(重量)，n  = 170(Snx33-/-)。统计：t检验或非参数 Mann–Whitney- U检验。比例尺 = 10 μm。p  < 0.001 (***)、p  < 0.01 (**)、p  < 0.05 (*)。箱线图：下铰链和上铰链对应于第 25 个和第 75 个百分位数。上部须线从铰链延伸至最大值，但不超过 1.5*IQR。下部须线从铰链延伸至最小值，但不低于铰链的 1.5*IQR。胡须之外的数据：黑点。黑线：中位数。黑点：意思。
 

　　Snx33 支持曲率相关的物体躲避
 

　　迄今为止，我们的数据表明膜曲率结合蛋白 Snx33 调节肌动蛋白聚合、前沿形态和稳定性。前缘图案可以通过减少持久性和促进随机规避动作来促进适应性运动。但 Snx33 介导的膜肌动蛋白耦合的特殊形式表明了一种额外的、更直接的效应，其中推进力特别是在细胞路径中可能存在障碍的情况下减少，即外部压痕产生增加的分数具有向内弯曲的区域。因此，Snx33 可以促进细胞转向，因为碰撞产生的膜变形会局部下调推进力，从而重新定向前缘。为了检验这个假设，我们首先将细胞定位在微流体装置46、47中，它们在其中迁移通过通道并遇到不同尺寸孔形式的障碍物。Snx33-/- dHL60 细胞需要比野生型细胞多几乎 20% 的时间来导航这些决策点并找到阻力最小的路径(图 4a，补充图 12a、b 和补充 视频8  )。由于细胞核已被证明可以作为沿着最小阻力路径的机械引导46，因此我们通过原子力压痕测量了核刚度，并排除了 Snx33-/- 细胞中核力学受到的影响(补充图 12c，d) ，与它们保留的读取孔径的能力一致(补充图 12b)。然而，在无决策通道中，Snx33-/-细胞的迁移速度比野生型细胞快80%，包括在通过单个收缩通道期间(图4b、 补充图 12e和补充视频 9)。接下来，我们用均质化学引诱剂量化了 2D 平面基底上的无限制迁移，促进细胞运动，而不需要细胞适应任何障碍(图 4c，详细信息请参阅方法 )。与在无决策通道中一样，Snx33-/-细胞比野生型细胞迁移得更快(图 4d)。此外，虽然Snx33-/-细胞的运动性更持久，但野生型细胞更倾向于进行大的自发转动(图 4e)。因此，Snx33的缺失似乎使细胞不太容易自发转动，并且在绕行物体时效率较低，同时在无决策环境中表现出更持久的迁移。这些迁移表型与我们在 Snx33-/- 细胞中观察到的前缘尺寸和质膜张力的增加一致(图 2d-h))。总之，这些观察结果表明 Snx33-/- 细胞的推进能力有所提高，但在面临障碍时缺乏适应能力。
 

　　图 4：Snx33 通过抑制 WAVE2 复合物来引导单细胞 2D 和 3D 迁移中的细胞运动。
 

　　a细胞中的决策通道通过时间(n wt  = 159，平均值 = 1.67 分钟；n Snx33-/-  = 9；平均值 = 1.96 分钟)(p  = 0.02，Mann–Whitney- U -测试，两侧)。b细胞中的收缩通过时间(n wt  = 234，n Snx33-/-  = 158)(p  = 2.2e-16，Mann–Whitney- U-检验，两侧)。c wt 和 Snx33-/- 细胞中细胞体随时间的位移。时间范围(5 秒)采用颜色编码。d wt 和 Snx33-/- 细胞的细胞速度(p  = 7.661e-5，Mann–Whitney- U检验，两侧)e细胞在迁移过程中转动的角度分布(p  = 0.0007583，Mann–Whitney- U测试，双面)。N wt  = 82，n Snx33-/-  = 78。数据来自 3 个独立的生物重复。f两个 wt 或 Snx33-/- dHL-60 细胞之间接触事件的分割。阴影突出显示接触持续时间。g wt (n  = 18) 和 Snx33-/- ( n = 20) dHL-60 细胞中与另一个细胞接触的细胞周长百分比 (p  = 0.0001704，Mann–Whitney- U检验，两侧)。h使用各种技术测量的曲率大小的可视化。i通过 SBEM 成像显示单个和碰撞的迁移 dHL-60 细胞的横截面。N single  = 6，n collided  = 6。j单个和碰撞迁移单元前缘绝对曲率值的可视化(来自i)。k直方图，显示单个像元和碰撞像元前缘的绝对曲率值分布(n个单个像元 = 6，n 个碰撞像元 = 6)。数据点表示每个单元格的平均值。lxy平面的单个和碰撞的迁移 dHL-60 细胞的膜标记 (CAAX)，通过点阵光片绘制。m单个和碰撞迁移细胞前缘绝对曲率值的可视化(来自l)。n直方图显示晶格光片图像中单个细胞和碰撞细胞前缘的绝对曲率(n个单个 = 5，n个碰撞 = 5)。数据点表示每个单元格的平均值。o带有荧光标记的 Snx33 和 Hem1 的 wt dHL-60 细胞中细胞与细胞接触的明场和p TIRFM 成像。箭头指向细胞与细胞的接触。n  = 3. q WAVE2 在 wt (n  = 9) 和 Snx33-/- ( n  = 10) dHL-60 细胞中细胞接触后的倍数变化( p  = 0.01816, t  = -2.5877, df = 18.789, 两个双面)。比例尺 = 10 μm。p  < 0.001 (***)、p  < 0.01 (**)、p  < 0.05 (*)。箱线图：下铰链和上铰链对应于第 25 个和第 75 个百分位数。上部须线从铰链延伸至最大值，但不超过 1.5*IQR。下部须线从铰链延伸至最小值，但不低于铰链的 1.5*IQR。胡须之外的数据：黑点。黑线：中位数。黑点：意思。
 

　　为了进一步了解 Snx33 缺陷细胞的物体逃避反应，我们设计了一种还原性测定法来测试接触运动抑制 (CIL)，这是许多细胞类型(包括 dHL-60s)中的常见现象，其中细胞停止在当它们与另一个细胞或物体24、48接触时，它们会朝特定方向移动。为了测试 CIL 作为对细胞障碍的反应是否受 Snx33 控制，我们接种了更高密度的 dHL-60 细胞，并通过 TIRFM 在细胞间相互作用的情况下对它们的 2D 迁移进行成像。与野生型细胞相比，Snx33-/-细胞形成更大的细胞-细胞接触(图 4f，g)，这与它们在面对惰性障碍时增加的决策时间一致(图 4a)。我们的计算结果与观察到的 Snx33 定位(图 1h-m)表明优先结合到向内弯曲的区域。为了评估细胞之间碰撞时质膜几何形状发生的变化，我们量化了碰撞后自由移动细胞和成对细胞前缘的曲率差异。我们进行了连续块面扫描电子显微镜(SBEM)，手动分割质膜，并量化了xz平面中碰撞和单细胞前面的自由和接触区域的曲率(图 4h- k  )。此外，为了排除潜在的固定伪影，我们使用膜标记(CAAX)和xy平面上的晶格光片(LLS)成像分析了自由迁移和碰撞活细胞的前缘(图4l-n和补充 图13f  ) -我)。在这两个数据集中，我们观察到单个细胞和碰撞细胞之间正面的曲率分布发生变化。虽然单细胞表现出偏向外曲率的更广泛分布，但接触表面的特征是以零为中心的更窄分布，这与接触部位的整体平坦化一致。细胞与细胞的接触抑制了正曲率和负曲率(补充图 14a-d)。
 

　　为了进一步剖析 Snx33 在 CIL 中的分子作用，我们同时对活细胞前缘的中性粒细胞 WAVE2 复合物(使用 Hem1)和 Snx33 进行成像。虽然这两种蛋白质在很大程度上共定位于细胞的大部分部分，但它们在前缘的高度负弯曲边缘中呈反相关(补充图 15a、b)。在这里，Snx33水平下降，而WAVE2积累(补充图 15c，d)，这与Snx33被排除在向外弯曲区域之外并限制WAVE与这些区域的结合一致。此外，当细胞碰撞时，Snx33定位于细胞接触区域，随后WAVE2消失并重新定位到质膜的无接触区域(图4o，p)。随后，细胞通过形成新的前沿而重新极化(图 4o，p)。为了评估 Snx33-/- 细胞中功能失调的 CIL 反应是否是由于接触区域的 WAVE2 抑制受损所致，我们在 Snx33-/- 细胞碰撞前后跟踪了 WAVE2 定位(补充视频 10  )。与野生型细胞相比，Snx33-/-细胞确实未能从接触位点去除WAVE2(图 4q和补充图 15e)。总而言之，我们展示了曲率感应蛋白 Snx33 在 CIL 期间调节肌动蛋白聚合中的关键作用。具体来说，Snx33 取代了细胞与细胞接触区域的 WAVE，从而在与障碍物碰撞时导致细胞向无接触区域重新极化。
 

　　讨论
 

　　物体逃避不仅是免疫细胞和癌细胞在复杂组织环境中迁移的关键，而且也是胚胎发生和体内集体迁移的基础49。结合遗传扰动、显微镜和微流体，我们发现了免疫样细胞适应性运动背后的曲率传感机制。我们发现，BAR 结构域蛋白 Snx33 可以读出膜曲率景观的变化，并反馈给肌动蛋白聚合机制，以调节迁移细胞前缘的复杂模式。具体来说，Snx33 抑制肌动蛋白聚合并调节 WAVE2(中性粒细胞中主要成核促进因子)的定位。因此，Snx33 限制了前缘的持续性并降低了迁移方向性。这种促进细胞迁移过程中自发重新定向的机制补充了丰富表达的 I-BAR 结构域蛋白的机制，其中向外曲率传感与肌动蛋白聚合的局部激活相结合增强了探索性细胞行为22。虽然很少有其他 BAR 结构域蛋白含有对肌动蛋白聚合具有抑制作用的结构域，但它们可能并不完全冗余。我们设想它们的作用机制将是多种特性的结果，包括曲率敏感性、结合强度、结合伙伴以及存在的其他域。因此，BAR 结构域蛋白成为多功能工具，可以局部激活或抑制肌动蛋白聚合，从而赋予细胞对其前缘的功能控制。
 

　　自发地重新定向和探索具有动态突出物的微环境的能力本身有助于在拥挤的环境中更有效地导航6,22,44,46,50,51。此外，突出活动的曲率依赖性下调还可以通过引导细胞远离外部最有可能存在障碍物的方向，更直接地帮助躲避物体。事实上，我们证明 Snx33 是细胞绕过惰性障碍和细胞障碍并从而在复杂的三维环境中迁移的关键。迄今为止，人们对协调 CIL 的分子机制知之甚少。srGAP2 是一种结合向外膜曲率的 BAR 结构域蛋白，显示在 CIL 52、53、54、55期间诱导突出。我们的研究表明，向内弯曲感应蛋白 Snx33 在抑制 CIL 期间肌动蛋白聚合方面发挥着关键作用。具体来说，我们表明多结构域蛋白 Snx33 定位于细胞与细胞接触并将 WAVE2 重新分配到自由表面，从而重新定向细胞。这可能以依赖于曲率的方式发生，因为Snx33优先定位于向内弯曲的膜区域，而WAVE2被限制于前缘23处的向外弯曲的区域。在细胞与细胞接触处，我们使用测量曲率值相差一个数量级的两个数据集来识别曲率分布的明显变化。具体而言，碰撞时，曲率分布比迁移单细胞的自由前缘的曲率分布更窄，这与碰撞时膜变平一致。Snx33 PX-BAR 二聚体的预期曲率灵敏度对应的曲率高于细胞-细胞碰撞时测量的曲率。然而，值得注意的是，BAR 结构域蛋白具有辅助结构域，可以形成寡聚体以及线性聚集体，以相当低的曲率56、57、58结合膜。此外，我们对细胞的观察仅限于曲率半径，其大小高于各自的图像分辨率极限，并受到可检测的曲率长度尺度的限制。因此，在未来，探索形成组装以及辅助结构域的存在/不存在如何允许 BAR 结构域蛋白跨越更大的曲率半径以响应分子复杂性内膜形状的更大规模变化将是很重要的。细胞19 , 59。
 

　　在这里，我们表明 Snx33 对肌动蛋白聚合的调节对细胞迁移具有重要影响。这与 BAR 结构域蛋白固有的曲率传感特性以及 CIL 期间细胞间碰撞时观察到的膜曲率分布变化相结合，表明膜曲率改变直接适应性细胞行为的机制。总之，我们的研究支持了这样的观点：细胞利用其膜地形来编码有关它们遇到的外部环境的信息。
 

　　鉴于细胞中存在的 BAR 结构域蛋白的多样性，我们预计这种调节原理可能用于许多必须对形状变化做出反应的生物功能，从亚细胞水平(细胞器稳态、膜运输)，通过单-细胞水平(免疫监视、肿瘤传播)到多细胞水平(原肠胚形成、组织折叠)。
 

　　方法
 

　　细胞培养
 

　　HL-60 细胞在含有 10% 热灭活 FBS (#10500-064, Gibco) 和 1% 青霉素-链霉素 (#15140-122, Gibco) 的 RPMI 1640 培养基中于 37 °C、5% 的加湿培养箱中生长二氧化碳2。通过添加 1.5% DMSO(#D2438，Sigma Aldrich)来分化细胞，并在 5 天后使用。每个独立区分的批次被视为生物复制。对于饥饿，将细胞在含有 0.3% 无脂肪酸 BSA(#A7030-10G，Sigma Aldrich)的无 FBS RPMI 1640 培养基中保存 1 小时。为了成像或固定，将 dHL-60 细胞铺在纤连蛋白包被的(0.01 mg/ml，#356008，Corning)玻璃底培养皿(#627860，Greiner bio-one)上，并在生长培养基中粘附 10 分钟。接下来，洗涤细胞并用 10 nM fMLP(#F3506-5MG，Sigma Aldrich)刺激。为了降低粘附力，涂层中添加了 5% 摩尔 BSA(#A7030-10G，Sigma Aldrich)。为了生成带有荧光标记的 Snx33 及其截短物(PXBAR 和 ΔPXBAR)以及 Hem1 和 CAAX 的稳定细胞系，如前所述使用慢病毒转导44。细胞在 EMBL 流式细胞术核心设施的 BD FACS Aria™ Fusion 上进行分选。
 

　　通过 CRISPR/Cas9 产生敲除细胞系
 

　　如前所述，在 HL-60 细胞中进行 CRISPR/Cas9 生成45。简言之，将靶指导序列克隆至靶Snx33 ，进行60、61(正向：CACCGctgggacgacGGATGCACAG；反向：aaacCTGTGCATCCgtcgtcccagC )。表达 BFP 标记的 Cas9 的细胞在 EMBL 流式细胞术核心设施的BD FACS Aria TM Fusion上的 96 孔板中进行单细胞分选。单细胞克隆通过 Touchdown PCR 62 的基因组 DNA 扩增和测序进行验证，然后对选定的克隆系进行蛋白质印迹。
 

　　RNA测序
 

　　根据制造商的说明，使用 RNeasy Mini Kit(#74104，Qiagen)纯化从 3 个生物重复获得的总 RNA 样品，并进行 DNase 消化步骤(#79254，Qiagen)。为了确保高质量，样品在 Agilent 2100 生物分析仪(Agilent Technologies)上进行分析。RNA 测序是在 EMBL 基因组学核心设施的 Illumina NextSeq 500 平台(NextSeqHigh-75 SE)上进行的。为了进行序列比对，使用了 hg19 参考基因组。使用 DESeq2 软件包通过定制 Galaxy 管道进行差异表达分析。RNAseq 数据已存入 BioStudies 的 ArrayExpress 馆藏，登录号为E-MTAB-12436。
 

　　影像学
 

　　活细胞的 TIRFM 图像是在 Nikon Ti Eclipse 倒置显微镜上采集的，配有 CFI Plan Apo Lambda 100x Oil(#MRD01905，尼康)硅胶物镜和由 NIS-Elements(尼康)控制的 sCMOS 相机。使用自动对焦系统(Perfect Focus，尼康)进行延时成像可减少样品漂移。
 

　　固定细胞的共焦图像是在 EMBL 先进光学显微镜设施的 Olympus FV3000 倒置显微镜上使用 UPLSAPO 60X S(NA 1.3；WD 0.3 mm)硅胶物镜获得的。
 

　　使用 40 倍物镜(#MRD00405，尼康)、SOLA SE II 和 100 W 卤素灯(尼康)并使用适当的滤光片组，对固定细胞进行落射荧光和明场成像。
 

　　偏振 TIRFM (pTIRFM) 模式是在以前的工作63、64、65、66、67、68的基础上实施的。为了成像，在用碳花青染料 DiI(#D3911，ThermoFisher Scientific)铺板前对 dHL-60 细胞进行染色。
 

　　使用适当的滤光片组和 10 × 550 μm 基光束，在 Zeiss Lattice Light Sheet 7(Zeiss，Oberkochen，德国)上进行活细胞的点阵光片成像。
 

　　图像分析
 

　　对于共焦图像(图 1g和补充图 15b)，基于覆盖整个重新切片最大强度 z 投影的线扫描，仅考虑包含 mCherry-CAAX 最高 80% 强度的z平面。感兴趣的通道 (ChoF1) 用于基于自动 Otsu 分割的掩模生成。定制的 ImageJ 脚本允许我们使用内置的 Coloc2 ImageJ 插件，基于 ChoF1 的掩码，计算 ChoF1 和 ChoF2 的每个z平面的皮尔逊相关系数 (PCC)。Z切片被分配到 10 个箱，并计算每个箱的平均值以及平均值的标准误差。
 

　　为了分析 TIRFM 成像的迁移细胞(图 2b-f、图 3b-d和图 4c-e)，细胞掩模(基于 mCherry-CAAX 信号)和 WAVE2 掩模(基于eGFP-Hem1 信号)是使用基于机器学习的 ilastik 软件(版本 1.3.1b1 和 1.3.3post3)获取的27。使用 Python 实现的内部构建程序实现了进一步的图像分析。根据连续三个帧的质心计算细胞移动的角度。前沿被定义为两个连续帧之间的差异，其中每个簇存在至少一个 WAVE2 掩模像素。前缘长度定义为前缘外周的像素数。为了分析细胞-细胞接触，使用相同的分割策略来分割单个细胞。细胞-细胞接触被定义为两个细胞的周界相交。
 

　　对于SEM数据的膜形貌分析(图 3e，f，补充图 8j，补充图 11a-c)，在中值滤波图像上手动分割带有褶边的前缘区域。接下来，使用Meijering滤波器69在分割区域内检测脊。随后使用自动 Otsu 阈值对脊进行分割，并使用自定义 Python 脚本进行骨架化。每个前缘区域的骨架化内的像素数量的反转对应于有效褶皱波长。
 

　　为了分析 SBEM 和晶格光片图像的膜曲率(图 4i-n和补充图 13b-e、g、i)，在前缘(定义为质膜前面的区域)手动分割质膜。核)或分别使用带有膜信号的荧光通道上的 Otsu 阈值进行分割，然后进行手动管理。接下来，使用自定义 Python 脚本，通过将圆拟合到具有用户定义长度(指定半宽的 2 倍 + 1 像素)的窗口，沿着分段膜滑动来量化曲率。为了确定曲率的符号，将基准点手动添加到图像中以指向细胞内部(补充图 14a-d)。
 

　　为了根据点阵光片图像(图 1m和补充图 5)分析与膜相关的蛋白质位置，仅在 MIP 中具有可见膜皱褶的细胞包含在分析中。通过 Mejiering 过滤和 Otsu 阈值处理，在 MIP 中对褶边进行分割。对于用户定义的 ROI 中的所有像素，提取膜和 Snx33 通道的z线并标准化为其峰值强度。为了解释不同x – y位置处细胞厚度的变化，通过定位与顶部和底部细胞膜相对应的膜通道中的峰值来对z线进行归一化(所有检测到超过 2 个峰值的z线均被排除在外)分析)。然后将归一化的z线分成对应于底部和顶部细胞膜的两半，然后通过计算Snx33和膜通道之间的重叠来评估每一半的Snx33共定位。所有显示低重叠的z线半部均被排除在进一步分析之外。接下来，将对应于一个细胞的所有z线合并并分成褶边内组和褶边外组以及顶膜和底膜亚组。为了允许在褶边内和褶边外组之间进行无偏比较，调整每组中的z线分布以包含相同频率的单元厚度。实际上，由于褶边外组比褶边内组包含更多的z线，所以对褶边外组进行随机二次采样以重构褶边内组中的分布。最后，由于单个z线的 SNR不允许准确评估 Snx33 到膜的距离，我们采用 bootstrap 进行平均，其中对每组中的随机 100 个z线进行平均并重新标准化为其峰值强度。然后测量膜通道和 Snx33 通道中信号首次达到 20% 的位置之间的距离。然后多次重复此过程以生成捕获原始数据异质性的距离分布。对于每个细胞，提取 4 个亚组中每个亚组的平均值，并对它们进行比较以验证该方法的稳健性。
 

　　基于 PDMS 的设备中的细胞迁移测定
 

　　基于PDMS的微流体装置的制备如前所述46、70、71。用于迁移 dHL-60 细胞的装置的决策点通道和收缩通道的高度分别为 2.8 和 3.13 μm。决策通道在两种排列中具有 2、3、4 和 5 μm 的收缩。具有单个收缩的通道为2μm。为了可视化细胞核和细胞体，在将细胞引入 PDMS 装置之前添加 Hoechst 33342(#62249，Thermo Fisher Scientific)和 TAMRA(Invitrogen)。使用配备 Lumencor 光源(390 nm、475 nm、542/575 nm)、孵育室和带有CO 2的加热台。使用 ImageJ 分析获取的数据并手动整理。仅考虑移动穿过整个通道的单个细胞进行分析。所有参数均根据核信号进行量化。
 

　　使用原子力光谱进行系链挤出
 

　　通过挤压质膜系链来测量表观膜张力。为了进行测量，将 Bruker 的 Olympus BioLever ( k  = 60 pN/nm) 安装在带有 JPK SPM 软件 6.1.183 的 CellHesion 200 AFM (Bruker) 上，该软件集成到 Eclipse Ti 倒置光学显微镜 (Nikon) 中。使用热噪声方法校准悬臂并涂有 2.5 mg/ml Concanavalin A(#C5275，Sigma Aldrich)。测量之前，用 dPBS 冲洗悬臂。对于系绳测量，将悬臂放置在细胞上方，最好放置在前缘上方。静态系绳拉动实验的测量参数如下：接近速度设置为1μm/s，接触力设置为100-300pN，接触时间设置为5-10s，回缩速度设置为10μm/s。拉动 10 μm 的系绳后，悬臂位置保持不变直至断裂，但不超过 30 秒。在每次实验重复中，条件的顺序都是随机的。对于每个细胞，至少进行 3 次不同的系链测量。
 

　　使用JPK数据处理软件6.1.183进行数据分析。为了根据系绳力测量来评估膜张力的大小，使用了以下公式44：
 

　　�=�028��2
 

　　(1)
 

　　其中F 0是 AFM 测量的系绳力，B是质膜的弯曲刚度，我们假设它在不同的实验条件之间保持不变( 基于之前的测量72 , 73为 2.7 × 10 -19 Nm )。
 

　　fMLP 刺激后非贴壁 dHL-60 细胞的 F-肌动蛋白染色
 

　　通过向生长培养基中的10 6 个细胞添加等体积的2x固定缓冲液来饥饿并固定细胞，或用10 nM fMLP刺激并在刺激后0、1和30分钟固定。固定缓冲液 (1x) 含有 3.7% 多聚甲醛(#28908，Thermo Scientific)、1x 细胞内缓冲液(140 mM KCL、1 mM MgCl 2、2 mM EGTA、20 mM HEPES，pH 7.5)、320 mM 蔗糖 (#S0389-500G ，Sigma Aldrich)和 0.2% BSA(#A7030-10G，Sigma Aldrich)。接下来，通过板离心，用 1x 细胞内缓冲液小心洗涤细胞，并在含有 0.2% Triton X-100(#T8787，Sigma Aldrich)的细胞内缓冲液(1x)中用与 TRITC(#P1951，Sigma Aldrich)偶联的鬼笔环肽染色 1 小时)。然后再次用细胞内缓冲液(1x)洗涤细胞。最后，将它们重悬于 1 ml 0.1% BSA、2.5 mM EDTA 的 dPBS 中，并在 EMBL 流式细胞术核心设施中使用 Cytek® Aurora (Cytek) 进行分析。使用 FlowJo 软件(版本 10.9.0)进一步分析数据并绘制图表。
 

　　免疫共沉淀
 

　　对于免疫共沉淀，通过病毒转导和细胞分选将 GFP 标记的 Snx33 及其截短物添加到 Snx33-/- 细胞系中。按照补充有蛋白酶抑制剂(#gtd，Chromotek)的 ChromoTek GFP-Trap Magentic Particles M-270 后，按照细胞质蛋白的建议进行 dHL-60 细胞的收获和裂解。过夜旋转后，使用 GFP-nanotrap 珠子从裂解物(全长 Snx33 和两个截短：PXBAR 和 ΔPXBAR)中沉淀 GFP 标记的蛋白质。在 2xSDS 样品缓冲液中进行洗脱并提交进行质谱分析。
 

　　蛋白质质谱分析
 

　　样品制备
 

　　使用二硫苏糖醇(56 °C，30 分钟，10 mM，50 mM HEPES，pH 8.5)和 2-氯乙酰胺(室温，黑暗中，30 分钟，20 mM，50 mM HEPES，pH 8.5)进行还原和烷基化。根据 SP3 协议制备样品(https://doi.org/10.15252/msb.20145625、https://doi.org/10.1038/s41596-018-0082-x )。简而言之，以 1:50 的酶与蛋白质比例添加测序级胰蛋白酶 (Promega)，在 37 °C 下过夜消化。通过收集磁体上的上清液并将其与第二次洗脱合并，在 50 mM HEPES(pH 8.5)中进行肽回收。
 

　　根据制造商的说明，用 TMT16plex 同量异位标记试剂 (ThermoFisher) 标记肽。简而言之，将 0.8 mg 试剂溶解在 42 µl 乙腈 (100%) 中，加入 8 µl 储备液，并在室温下孵育 1 小时。将反应用 5% 羟胺在室温下猝灭 15 分钟。使用 OASIS® HLB µElution Plate (Waters) 合并并净化样品。
 

　　质谱分析
 

　　UltiMate 3000 RSLC 纳米液相色谱系统 (Dionex)，配有捕集柱(μ-Precolumn C18 PepMap 100、5 µm、300 µm 内径 x 5 mm、100 Å)和分析柱(nanoEase™ M/Z HSS T3 色谱柱)使用 Nanospray Flex™ 离子源在正离子模式下将 75 µm x 250 mm C18、1.8 µm、100 Å，Waters)与 Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 质谱仪(Thermo)耦合。以 30 µl/min(0.05% 三氟乙酸水溶液)的恒定流速将肽浓缩到捕获柱上 4 分钟。随后，使用溶剂 A(0.1% 甲酸水溶液、3% DMSO)以 0.3 µl/min 的恒定流速和逐渐增加的溶剂 B(0.1% 甲酸乙腈溶液， 3% DMSO)在 4 分钟内从 2% 升至 8%，再持续 104 分钟从 8% 升至 28%，再用 4 分钟。从 28% 到 40%，最后 40%–80%，持续 4 分钟，然后在 4 分钟内重新平衡回到 2% B。
 

　　质谱仪参数如下：喷雾电压2.4 kV，毛细管温度275 ℃，MS1质量范围375~1500  m / z，轮廓模式，轨道阱，分辨率120000。最大填充时间50 ms， AGC 目标设定为标准。将 Orbitrap 的分辨率设置为 30000，填充时间为 94 ms，离子限制为 1 × 10 5 ，进行数据相关采集 (DDA )  。应用归一化碰撞能量 34。MS2 数据是在剖面模式下获取的。将第一个质量固定为 110  m / z。
 

　　质谱数据分析—Isobarquant
 

　　IsobarQuant 74和 Mascot (v2.2.07) 用于处理获取的数据。根据包含常见污染物和反向序列的智人蛋白质组数据库 (UP000005640) 搜索数据。搜索参数中包含以下修饰：脲甲基 (C) 和 TMT10 (K)(固定修饰)、乙酰基(蛋白质 N 端)、氧化 (M) 和 TMT10(N 端)(可变修饰)。对于全扫描 (MS1)，设置的质量误差容限为 10 ppm；对于 MS/MS (MS2) 谱图，设置的质量误差容限为 0.02 Da。设置了进一步的参数：胰蛋白酶作为蛋白酶，最多允许两次遗漏切割：最小肽长度为 7 个氨基酸；蛋白质鉴定至少需要两种的肽。肽和蛋白质水平的错误发现率设置为 0.01。
 

　　使用 R 编程语言 (ISBN 3-900051-07-0) 分析 IsobarQuant 的原始输出文件(蛋白质.txt 文件)。仅具有至少两个肽的蛋白质被包括在分析和定量中。总共 561 种蛋白质通过了质量控制过滤器。使用 limma (PMID: 25605792) 清理原始信号和(signal_sum 列)的批次效应，然后使用 vsn 进行标准化(方差稳定标准化 - PMID：12169536)。为了测试蛋白质的差异富集，使用了 limma 包。重复信息作为设计矩阵中的一个因素附加到 limma 的“lmFit”函数的参数中。命中被定义为错误发现率 (fdr) 小于 5% 且倍数变化至少 100% 的蛋白质，以及 fdr 低于 20% 且倍数变化至少 50% 的候选蛋白。质谱蛋白质组学数据已通过 PRIDE 75合作伙伴存储库存入 ProteomeXchange 联盟，数据集标识符为 PXD033666。
 

　　分子动力学模拟
 

　　粗粒度分子动力学模拟
 

　　使用 GROMACS 2021.4 76进行分子动力学模拟，使用粗粒度 Martini2.2 力场77 , 78并对所有蛋白质珠应用既定的缩放程序 (alpha = 0.7) 79 。
 

　　作为结构模型的基础，使用了 Snx33 膜结合域 (PX-BAR) 的现有晶体结构 (PDB ID: 4AKV)。由于该结构中缺少一些环，我们使用默认设置的 AlphaFold-multimer 80、81预测了相同的序列，但将循环次数增加到 6。所得模型与晶体结构非常一致(RMSD：2.3 Å)，并且直接用于模拟。结构模型是粗粒度的，使用“martinize.py”脚本78应用 DSSP 分配的二级结构约束，并使用跨两个子单元的弹性网络82 ，其中f c  = 500 kJ/mol −2和截止c  = 1.2 nm 如先前报道的其他扩展 BAR 蛋白的模拟19。对于所有无序线圈区域，所有弹性键均被移除。
 

　　然后将蛋白质置于弯曲膜上，该膜是根据以下程序压缩平坦膜而产生的。疯狂的计算脂质组学：用于生成用于分子模拟的定制膜的多功能工具。 J.化学。 理论计算。 11, 2144–2155 (2015)。">使用“insane.py”工具83制备尺寸为70 x 35 x 20 nm 3的平坦对称双层。使用通过质谱测定的质膜衍生的脂质组合物作为输入(表 S1)。将膜溶剂化并添加Na +离子以使系统电荷中性。然后使用最陡下降算法 1000 步将膜能量最小化。
 

　　随后，使用 Berendsen 恒压器84和速度重新调节恒温器85在 NPT 系综(半各向同性压力耦合)中以 20 fs 的时间步长对双层进行模拟 50 ns 。分别使用 1 ps 和 4 ps 的耦合时间。所有模拟中的温度均设置为 310 K。采用Verlet邻居搜索算法更新邻居列表，长度和更新频率自动确定。Lennard-Jones 力和库仑力在r c = 1.1 nm处截止 ，使用 Verlet 位移电位调节器将电位移至 0 86。
 

　　然后，将侧向压力设置为 10 bar 以生成屈曲膜结构(P x,y  = 10 bar，P z  = 1 bar)。从压缩轨迹中提取两种不同曲率的膜，盒子尺寸分别为 58.9 × 29.5 × 25.9 nm 3(多余膜面积 = 25.1 nm 2)和 56.3 × 28.2 × 28.3 nm 3(多余膜面积 = 31.4 nm 2)。
 

　　在这两个系统中，蛋白质都被放置在弯曲膜上方并重新溶剂化和电荷中和。使用上述设置进行简单平衡，并以f c  = 1000 kJ mol -1  nm -2维持对蛋白质的位置限制。平衡运行 250 ns。然后使用具有固定x、y尺寸和P z  = 1 bar 的各向异性压力耦合进行生产模拟。生产模拟进行了 30 µs。使用与上面相同的模拟参数，除了使用耦合时间为 20 ps 87的 Parrinello-Rahman 恒压器来控制压力。
 

　　图像和可视化是使用 VMD(版本 1.9.4)88制作的。使用 MDAnalysis 1.1.1 89、90和 python 3.6进行分析。为了分析弯曲膜上蛋白质的曲率偏好，Bhaskara 等人先前建立了协议。使用了17 (参见：https: //github.com/bio-phys/MemCurv)。通过优化最小二乘拟合，每 1 ns 将高度函数h (x,y) 的二维傅里叶展开拟合到膜的磷酸盐珠上。随后，从拟合高度函数h ( x , y )的形状算子导出平均曲率 H 。计算蛋白质质心的x、y位置以及随机选择的磷酸盐珠位置的平均曲率 H，以在每个考虑的帧对背景膜进行采样。
 

　　扫描电子显微镜 (SEM)
 

　　10 nM fMLP 刺激 30 分钟后，通过直接添加 37 °C 双倍强度固定剂(0,1 M PHEM 中的 5% GA)将细胞固定在 0,1 M PHEM 缓冲液中的 2.5% GA(#16220，EMS)中 1 :1 至细胞培养基。孵育10分钟后，用新鲜的单浓度固定剂替换固定剂，并在室温下进一步固定细胞1小时。固定后，将细胞在0.1M PHEM中洗涤2次，并在0.1M二甲胂酸盐缓冲液中洗涤2次。接下来，将它们在新鲜制备和过滤的 1% OsO 4 (#19190，EMS) 和 0.8% 亚铁氰化钾 (K 4 [Fe(CN) 6 ]*3H 2 O，#4984，Merck)中后固定 2 小时。在 0.1 M 二甲胂酸盐缓冲液中。后固定后，将细胞在H 2 O中洗涤4次，并置于4°C直至进一步处理。
 

　　接下来，使用 Pelco BioWave 微波炉，用新鲜制备并过滤的 1% 单宁酸(TA，CAS#1401-55-4，EMS)水溶液处理细胞，在 150 W 和 0 W 功率之间交替进行七个 1 分钟循环。稳定温度设置为 23 °C，所有步骤均开启真空。TA 处理后，在工作台上用H 2 O洗涤细胞 2 次，并在微波炉中用H 2 O 洗涤 2 次，每步 40 秒，功率为 250 W。然后使用与 TA 相同的微波程序，用 1% UA (#77870, Serva) 的 H 2 O溶液处理细胞。在 H 2 O 中洗涤一次并在 25% EtOH 中洗涤两次后，使用具有步长的微波程序在分级系列乙醇 (25%–50%–75%–90%–100%–100%) 中脱水40 秒和 250 W 功率，稳定温度为 4 °C，无真空。最后，使用具有 6 个微波程序的乙醇 (25%–50%–75%–100%–100%) 溶液梯度系列六甲基二硅氮烷(HMDS，CAS# 999-97-3，Sigma Aldrich)浸润细胞。每个步骤 1 分钟，步骤 1、3、4 和 6 的功率为 150 W，步骤 2 和 5 的功率为 0 W。最终 100% HMDS 渗透后，除去所有 HMDS，并让盖玻片干燥过夜。将带有水分指示剂的硅胶(Merck)添加到24孔板的4个空孔(角落)中以除去多余的湿度。
 

　　干燥后，使用碳带将盖玻片安装在铝棒(Agar Scientific G301F)中，并使用 Q150RS 型 Quorum 溅射镀膜机在 30 mA 电流下溅镀一层金，持续 180 秒。
 

　　成像在 Zeiss Crossbean 540 显微镜上进行，使用 5 kV 加速电压和 700 pA 电子束电流，工作距离为 5 mm。使用二次电子探测器 (SESI) 进行信号检测，所有图像均以 28.9 nm/像素的像素大小获取。
 

　　串行块面扫描电子显微镜 (SBEM)
 

　　在 MatTek 培养皿中进行 10 nM fMLP 刺激 30 分钟后，通过直接添加 37 °C 双倍强度固定剂(0.1 M PHEM 中的 5% GA)将细胞固定在 0.1 M PHEM 缓冲液中的 2.5% GA(#16220，EMS)中 1 :1 至细胞培养基。孵育 10 分钟后，用新鲜的单一强度固定剂替换固定剂，并将细胞在固定剂中于 4 °C 孵育过夜。固定后，将细胞在 0.1 M PHEM 中洗涤 2 次，并在 0.1 M 二甲胂酸盐缓冲液中洗涤 2 次。接下来，将它们在 1% OsO 4 (#19190, EMS) 和 0.8% 亚铁氰化钾(新鲜制备并过滤)中的冰上后固定 1.5 小时(K 4 [Fe(CN) 6 ]*3H 2 O，#4984， Merck)在 0.1 M 二甲胂酸盐缓冲液中。后固定后，将细胞在H 2 O中洗涤4次，并留在4℃的H 2 O中直至进一步处理(5天)。
 

　　接下来，按以下顺序连续三个步骤对细胞进行染色：1% 硫代碳酰肼(TCH，#21900，EMS)水溶液、2% OsO 4水溶液和 1% UA(#77870，Serva)水溶液。对于所有三个染色步骤，细胞均在 Pelco BioWave 微波炉中处理，每个程序分为 7 步，功率在 100 W 和 0 W 之间交替(从 100 开始)，稳定温度设置为 23 °C，真空开启所有步骤。在每个染色步骤之间，将细胞在 H 2 O 中洗涤 4 次，在工作台上洗涤两次，在微波炉中洗涤两次(40 秒，250 W 功率，真空关闭)。
 

　　UA染色后，将细胞在H 2 O中洗涤一次，在25% EtOH中洗涤两次，然后在分级乙醇系列(50%–70%–90%–100%–100%)中进一步在微波中脱水。脱水步骤的微波设置为：时间 40 秒，功率 250 W，真空关闭，稳定温度 4 °C。
 

　　脱水后，将细胞浸润到乙醇(25%–50%–75%–100%–100%–100% durcupan)中的分级系列 durcupan 树脂(来自 Sigma 的 Durcupan ACM，#44611-#44614(四种成分))中)，使用微波，每步 3 分钟，功率 150 W，23 °C 稳定温度和真空循环。
 

　　最后，将细胞放在少量新鲜树脂上(覆盖 MatTek 培养皿的中心)并放置约 1-2 小时以蒸发残留溶剂和气泡。在聚合之前，除去大部分树脂(仅留下足以覆盖中心的树脂)。将一滴 durcupan 添加到 18 × 18 mm 盖玻片中(以避免滞留气泡)，然后将盖玻片放在 MatTek 培养皿中心的顶部。该组件在 60°C 的烘箱中聚合 2 天。
 

　　聚合后，通过锯切靠近盖玻片移除MatTek盘，并通过将组件浸入液氮和温水中移除圆形中心和平两侧的玻璃。
 

　　使用刀片从样品中切下一小块，并使用双组分银导电环氧树脂(Ted Pella，#16043)安装在 SEM 针(Micro to Nano Gatan 3View 针，#10-006003-50)上。样品的侧面还覆盖有银环氧树脂，最后使用 Q150RS 型 Quorum 溅射镀膜机在 30 mA 电流下溅镀一层金，持续 180 秒。为了固化银环氧树脂，样品在 60 °C 下总共固化了一天。
 

　　图像采集在带有 Gatan 3View 的 Zeiss GeminiSEM 450 上进行(DigitalMicrograph 版本 3.51.3720.0；SmartSEM 版本 6.06，带有 Service Pack 4)，安装了用于控制采集的程序 SBEM Image (2021.08.dev) 91。对于图像采集，使用 1.5 kV 的加速电压、300 pA 的束流、10 nm 的像素尺寸和 1.6 µs 的停留时间。使用点 BSE 检测器进行检测，对比度设置为 99.9%，亮度设置为 11.8(带倒置 LUT)，BSD 偏置为 -5 V。切片厚度设置为 40 nm。在每个周期之间，以 165.76 nm 像素大小和 0.8 µs 停留时间采集概览图像。
 

　　统计分析
 

　　使用 R(版本 3.2.1)进行统计分析，同时使用 R 和 Adob​​e Illustrator® 进行数据可视化。数据分布的正态性通过Shapiro-Wilk检验进行检验。双尾t检验用于正态分布。否则，如果没有不同说明，则使用非参数 Mann–Whitney- U检验。在所有箱线图中，下铰链和上铰链对应于第一和第三四分位数(第 25 个和第 75 个百分位数)。上须线从铰链延伸到最大值，但不超过 1.5*IQR(第一四分位数和第三四分位数之间的距离)。下部须线从铰链延伸至最小值，但不低于铰链的 1.5*IQR。晶须末端以外的数据绘制为黑点。黑线和点分别对应于中位数和平均值。所有测量均取自不同的样品。