体外高效电转化仪的操作要领
时间:2022-07-26 阅读:8262
胞电转染(电转),也叫细胞电穿孔(electroporation),是把外源大分子物质DNA、RNA、siRNA、蛋白质等以及一些小分子导入细胞膜内部的重要方法。
体外高效电转化仪在瞬间强大电场的作用下,溶液中细胞的细胞膜具有了一定的通透性,带电的外源物质以类似电泳的方式进入细胞膜。由于细胞膜磷脂双分子层的电阻很大,细胞外部电流场产生的细胞两极电压都被细胞膜承受,细胞质内分到的电压可以忽略不计,细胞质内部几乎没有电流,因此也决定了正常范围内的电转过程中细胞毒性很小。电场使DNA等物质进入细胞膜后只能停止在细胞膜附近,随后细胞本身的机制可以允许这些物质到细胞核等处。
体外高效电转化仪使用:
1.选择合适的电场强度合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的*佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的电场强度。
2.细胞的选择用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2d)。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛,表面结构致密比稳定期的细胞差,电转后,细胞膜的恢复能力强,而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA。
3.质粒的质量应选择纯度高的质粒,DNA/RNA应该超纯(A260/A280>1.8),其次应不含内毒素,同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。另外,DNA浓度不宜过高。
4.选择合适的电转染试剂电击会对细胞造成一定程度的伤害,在转染试剂的选择上要注意,应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂,如Entranster-E,可将电击对细胞的损伤降低。