01背景

这篇文竟是关于拉曼自动化反馈控制多种补料成分以实现高接种密度增强型fed-batch平台过程的研究论文。该研究旨在开发控制策略，通过在线拉曼光谱法监测和调整代谢物浓度，以实现高接种密度下的细胞培养过程中的高产量和稳定性。具体使用了增强型high inoculation density (HID)高接种密度培养fed-batch平台过程来培养五个不同谷氨酰胺合成酶piggyBac®中国仓鼠卵巢细胞CHO克隆。通过在线拉曼光谱法连续监测残余glucose葡萄糖、phenylalanine苯丙氨酸和methionine 甲硫氨酸的浓度变化，开发了partial least squares models偏最小二乘模型。通过持续监测残余代谢物浓度，自动调整三种补充成分的补料速率，从而保持葡萄糖、苯丙氨酸和甲硫氨酸在期望的设定点上，并确保其他营养物质浓度在所有培养的克隆中保持在可接受的水平。

02材料与设备

细胞系与培养

使用了Lonza HID平台的 GS piggyBac® CHO clones细胞系，共有5个克隆体。采用了100*10⁵的初始接种密度，在1L或者5L的体积进行培养。

模型建立

使用了SIMCA v16分别对glucose, phenylalanine and methionine进行建模处理。首先是光谱区域的选择，主要是基于了在纯水中他们各自的特征光谱范围。其次，通过 first derivative, Savitzky-Golay smoothing and standard normalvariate normalization (SNV) 的方法对原始光谱进行了预处理。建立的模型结果如Table 1所示。

参考已知的文献并结合所建模型的R²以及root mean squared error of estimation and cross-validation (RMSEE/RMSECV) ，初步判断模型可用。分对于glucose, phenylalanine, and methionine，如果RMSEPs 是 < 1 g/L, 100 mg/L and 100 mg/L，则判断结果模型结果是可用的。

03光谱采集与样品分析

在线拉曼光谱的收集使用了来自于Endress +Hauser的RXN2 system系列，有着 785 nm的光源并内置了Runtime 6.2的操作系统。探头使用了220 mm和420mm（分别在1L和5L的培养体积）的BioOptic探头。采用了5sx150 scan的曝光时间和曝光次数，总时长大约是12.5min。对于glucose, phenylalanine和methionine在线监测数据，首先通过OPC的方式传输到Delta-V(Emerson)，再在Delta-V对三个参数分别建立基于PID算法和on–off的控制回路，在监测值低于目标值的时候，可以自动添加SF1, SF2和 SF3。SF1, SF2, and SF3对别对应了glucose, phenylalanine and methionine的补料。

离线的样品是每日从HID的培养中取出送样检测。使用了来自于Nova Biomedical的Bioprofile FLEX2分化分析仪。对于氨基酸以及最后产物的分析分别使用了high-performanceliquid chromatography (HPLC)和Tridex Protein Analyzer (IdexHealth Sciences)

04结果


 

上诉三个图分别为glucose, phenylalanine和methionine的自动控制情况以及SF1, SF2, and SF3在5个clones分别的添加总量。glucose的平均RMSEP是0.49 g/L (limit < 1 g/L), phenylalanine的平均RMSEP是40.72 mg/L (limit 100 mg/L) ,methionine的平均RMSEP是42.01 mg/L (limit 100 mg/L)，都是在可以接受的标准之内的。

除此之外，文章还对其他的组分进行了监测，以探究在HID平台的自动回路控制培养模式对细胞生长代谢的影响。具体对比了培养体系中的histidine组氨酸、leucine亮氨酸、threonine苏氨酸和ryptophan色氨酸的变化，以评估拉曼自动回路控制对残留氨基酸浓度的影响。

可以看出，利用拉曼自动回路控制的方式，通过动态提供培养物所需的氨基酸，有助于降低克隆间代谢的差异性。

此外，为了进一步验证拉曼自动控制的HID培养的效果，研究人员通过Peak VCC、Harvest VCC、 Harvest viability、Harvest lactate、Harvest NH₄、Harvest product concentration六个维度来评估对细胞生长和产量的实际影响。可以看出，在HID平台上培养的所有克隆均获得较高的Peak VCC(320.5±32.3×10⁵) cells/ mL)，且直到收获当天，大多数HID培养保持在以上200.0×10⁵ cells/mL(4/5clones)。总的来说，除2 clone号外，在HID工艺上培养的所有克隆在收获时都有很高的活力(2clone的收获活力较低，是因为在培养结束时无意添加了碱基，导致VCC下降)。除2 clone，收获时培养存活率均大于85%。

在HID培养过程中使用的自动培养策略的另一个好处是代谢副产物的低水平。乳酸和铵是代谢副产物，其积累与抑制细胞生长有关。总体而言，在HID工艺下培养的所有克隆的平均乳酸收获浓度(0.8±0.5 g/L)和铵收获浓度(0.07±0.02 g/L)均较低，这表明以该种控制策略培养，不仅对氨基酸副产物的积累影响很小，而且对其他常见抑制副产物的积累影响也很小。

最后，本研究使用的5个clone在HID培养过程中获得了较高的收获产物浓度(6.5±1.2 g/L)。相比之下，本研究中获得的收获产物浓度平均略高于之前所报道的(6.5±1.2 g/L)。也可以得出结论，在本研究中观察到的较高的产品浓度，部分原因是由于提出的自动化策略可以维持高接种密度培养的营养需求，从而实现所需要补料操作的自动化，减少了危险副产品的积累。

05结论

该研究通过应用在线拉曼监控技术和自动化反馈控制策略，实现了高接种密度下的增强型细胞培养过程的稳定和高产量。这为生物制药行业开发更高效、成本更低的生产过程提供了新的思路和方法。

Webster, T.A., Hadley, B.C., Dickson, M., Hodgkins, J., Olin, M., Wolnick, N., Armstrong, J., Mason, C. & Downey, B. 2023, "Automated Raman feed-back control of multiple supplemental feeds to enable an intensified high inoculation density fed-batch platform process", Bioprocess and biosystems engineering